硒化鎘量子點對人成纖維上皮細胞的毒理學研究.pdf

1、[目的]
　　 半導體納米粒子-量子點(Quantum dot,Qdot)是一種新型的納米材料,其半徑小于或接近于激子玻爾半徑的納米微粒,又稱半導體納米晶(semiconductor nanocrystal)。量子點一直是材料、電子、物理等學科領(lǐng)域的研究熱點,近年來由于其具有獨特的光譜特征、良好的生物相容性。加上可適應性和高通量的分子識別等特性,在生命科學的多個領(lǐng)域取得了突破性的進展。
　　 量子點優(yōu)越的熒光特性使之可以

2、用于熒光標記,進而成為一類理想的生物熒光探針。在生物醫(yī)學領(lǐng)域。量子點的具體應用主要在于:可以在細胞水平成像,觀察細胞器的各種狀態(tài);可以進行生物分子多組分的測定,對干擾的雜質(zhì)分子有很好的消除作用;可以對多種蛋白質(zhì)進行標記,從而檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用等等。當然量子點在生物體系中的應用遠不止這些,它還可以應用于生物芯片、溶液矩陣、醫(yī)學成像等方面。
　　 可以看到,量子點的生物學應用基本上都是基于量子點對生物細胞無害的假設(shè)上面

3、。目前關(guān)于量子點的生物學效應以及其藥代動力學和毒理學的研究還處于起步階段,文獻報道也主要是一些觀察性報道,如觀測量子點在靜脈注射后位于體內(nèi)的分布以及不同包被修飾后量子點的代謝情況。但是,在分子水平上量子點是否對細胞的生理功能產(chǎn)生影響,尤其是對人體細胞的影響如何則更是值得人們關(guān)注的。
　　 一個化合物對細胞在分子水平的影響可從其對細胞中最重要的兩大類物質(zhì)即蛋白質(zhì)和DNA的影響來研究。對DNA的干擾是許多化合物導致細胞生理功能改變的

4、主要途徑,如對堿基的修飾,造成DNA單鏈斷裂(single strand breaks,SSBs),雙鏈斷裂(double strand breaks,DSBs),鏈間或鏈內(nèi)的交聯(lián)(cross-link)等。由于對DNA的損傷可影響到遺傳性狀的改變,因此這種DNA損傷功能的特性被稱為“遺傳毒性”。在各種DNA損傷中,DSBs被認為是最嚴重的一種。
　　 研究發(fā)現(xiàn),細胞在受到DNA損傷尤其是DNA雙鏈斷裂損傷后,在DNA雙鏈斷裂位

5、點會發(fā)生一種H2AX蛋白的磷酸化。作為與真核細胞DNA相結(jié)合的組蛋白成分。H2AX的C端結(jié)構(gòu)域中舍有一個Set殘基,當DSBs出現(xiàn)時.該殘基被磷酸化(稱為γH2AX)。γH2AX進一步募集其它DNA損傷修復相關(guān)蛋白到損傷位點,形成“焦點”結(jié)構(gòu),對DNA損傷進行感受和修復,因此是細胞應激反應中的重要成員。由于γH2AX的出現(xiàn)與DSBs緊密相關(guān),γH2AX成為檢測細胞DNA損傷的一個新的特異性指標。
　　 一些有研究顯示,以鎘硒或者

6、鎘碲為核心的量子點毒性部分來源于在溶液中游寓的鎘元素或者進入細胞后釋放的鎘元素。另一方面,以鎘硒或者鎘碲為材料的量子點具有光致氧化和空氣致氧化性,由此產(chǎn)生的自由基可能成為量子點毒性產(chǎn)生的又一大機制。為了增加量子點的穩(wěn)定性.拓寬其應用范圍以及減小核心材料的副作用,研究人員在鎘硒或者鎘碲量子點外層加上不同的包裹材料,以期減少可能的鎘元素釋放以及增加生物兼容性。ZnS是比較普遍應用的材料之一。它可以改善因為鎘硒碲等元素未滿電子層軌道所致的不穩(wěn)

7、定性。從而增強熒光效率。合成之初,量子點親水性較差,研究人員通過運用巰基丙酸(mercaptopropionicacid)和多聚乙二醇(polyethyleneglycol)(PEG)來增加量子點的水溶性并防止納米顆粒的聚集。
　　 鑒于以上原因。我們擬對量子點的細胞毒性和遺傳毒性進行深入研究。本課題選用人皮膚成纖維細胞(HSF)為靶細胞,分別檢測CdSeQDs以及有PEG包被的CdSeQDs對HSF細胞的細胞毒性作用:選用γH

8、2AX為檢測指標,運用免疫熒光技術(shù)研究這兩種材料對HSF細胞的DNA損傷作用;通過彗星實驗進一步驗證材料的遺傳毒性作用。使用熒光探針DCF檢測ROS水平,探討其在DNA損傷中的作用。為量子點對人皮膚成纖維細胞的影響提供毒理學依據(jù)以及探討其相應的機制。
　　 [方法]
　　 1、細胞培養(yǎng)和量子點處理:HSF細胞培養(yǎng)于lO％小牛血清、0.03％L-谷氨酰胺、104U·L-1青霉素、125mg·L-1鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中

9、。細胞傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期時,分別加入量子點440、680,使每組培養(yǎng)液中量子點終濃度分別達到8nM和80nM,于37℃，5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)2、8和24h。對照組用相同體積的等量PBS處理細胞。
　　 2、細胞毒性實驗：1)MTS比色法:用96孔板,分別用量子點440和680進行2，8和24h處理,每板內(nèi)分為空白組(未經(jīng)量子點處理）、量子點8nM、80nM處理組、試劑對照。細胞分別培養(yǎng)到相應的處理時間點后,加5g·L-1MTS2

10、0μl,37℃條件下繼續(xù)孵育45分鐘,終止培養(yǎng)。選擇490波長,在酶標儀上測定各孔光吸收值(A490)。
　　 2)臺盼蘭計數(shù)實驗:取75μl混有細胞的培養(yǎng)液,用75μl稀釋濃度為O.4％的臺盼蘭與之混勻,取50μl混合液,滴于計數(shù)板上,于顯微鏡下觀察計數(shù)。
　　 3、γH2AX檢測:
　　 1)免疫熒光:用量子點處理細胞不同時間點后通過免疫熒光手段檢測γH2AX在細胞核內(nèi)分布情況。
　　 2)Weste

11、rnblot:量子點處理后的細胞用westernblotting實驗檢測γH2AX蛋白的表達情況。
　　 4、彗星實驗:細胞用量子點處理績束后,離心收集,調(diào)節(jié)細胞濃度至6×1010L-1。制備“三明治”凝膠。依次進行裂解、25V電泳、DAPI染色,在熒光顯徼鏡下觀察結(jié)果。
　　 5、ROS機理檢測:在細胞處理結(jié)束后,用O.25％胰酶消化后,PBS重懸,加入DCFH-DA調(diào)至工作液濃度(20μM),避光孵育30min后,用

12、酶標儀在激發(fā)波485nm處進行檢測。6、雙向電泳:HSF細胞用PEG包裹的量子點在8nM或80nM處理24小時后,提取蛋白進行雙向電泳。
　　 [結(jié)果]
　　 1、無PEG包裹的量子點680在80nM濃度下作用24小時顯著影響細胞生存率。MTS實驗顯示,用有PEG包裹的量子點680和440在8nM和80nM條件下處理細胞24小時,細胞與對照組無顯著差異。而沒有PEG包裹的這兩種量子點在高濃度下作用于細胞8小時后開始顯示出

13、對細胞生存率的負面作用。臺盼藍實驗進一步表明8nM濃度下沒有PEG修飾的量子點680和440在24小時觀察時間內(nèi)對HSF細胞幾乎沒有影響:而量子點680在高劑量情況下顯示出細胞毒性,活細胞數(shù)量顯著降低。
　　 2、未經(jīng)PEG修飾的量子點在高濃度劑量下可引起γH2AX焦點形成。γH2AX焦點是檢測DNA損傷的敏感指標之一。免疫熒光實驗結(jié)果顯示量子點440和680在有PEG包裹的情況下在24小時內(nèi)形成的γH2AX焦點與陰性對照組相比

14、并沒有明顯區(qū)別。而暴露于高劑量量子點下的HSF出現(xiàn)γH2AX焦點的數(shù)量呈現(xiàn)出時間依賴性。Westernblot同時驗證了這種趨勢。
　　 3、中性彗星實驗表明無PEG修飾的量子點可引起DNA雙鍵斷裂。
　　 4、ROS是量子點引起γH2AX焦點的原因之一。
　　 5、有PEG修飾的量子點440和680對于蛋白表達水平的改變幾乎沒有影響。
　　 [結(jié)論]
　　 1、PEG是較好的減少量子點細胞毒性的