8-氧乙酰山梔酸甲酯抗腦缺血及促血管新生研究.pdf

1、中風與癌癥、心血管疾病被認為是主要導致人死亡的原因之一,嚴重危害人們的健康。腦中風是一種嚴重的神經(jīng)性疾病,是一個復雜多變的病理生理過程,其發(fā)病機理目前尚未完全闡明,目前提出的病理機制有興奮性氨基酸中毒、炎癥反應、氧化損傷、代謝性酸中毒、細胞內(nèi)鈣超載、線粒體損傷,細胞凋亡、免疫炎癥損傷、離子失衡、減少缺血半暗帶的神經(jīng)細胞死亡、神經(jīng)保護等學說。根據(jù)這些學說和機制而采取的治療措施以及研制的治療藥物,到目前為止尚未獲得滿意的療效。1995,美國

2、FDA批準的抗腦卒中治療藥物NINDS rt-PA在卒中發(fā)生后3 h內(nèi)使用可明顯改善中風3個月時的功能恢復,但卒中發(fā)生后3 h內(nèi)使用是其最大的缺陷。隨后發(fā)展的治療藥物尿激酶原(溶栓藥)在6h內(nèi)動脈給予可明顯改善中風的功能恢復,而中風發(fā)作超過3-6h若使用上述溶栓藥后可導致腦內(nèi)出血和腦水腫,而通?；颊咴诎l(fā)生腦卒中后的3-6h內(nèi)并不能及時到達醫(yī)院接受上述治療,所以患者能接受溶栓治療的幾率相對較低,不到5％。上述溶栓藥只在中風發(fā)作6h之內(nèi)使用

3、,大大限制了其應用。因此,尋找一個安全有效的既能用于腦卒中早期治療,又能用于后期功能恢復的藥物很有必要。迄今為止尚無符合上述條件的理想治療藥物。8-氧乙酰山梔酸甲酯(ND01)是山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心研究人員從中藥獨一味Lamiophlomisrotata(Benth.)Kudo.莖葉中提取分離出來的一種環(huán)烯醚萜化合物。前期對8-氧乙酰山梔酸甲酯在腦血管疾病方向進行了藥理學篩選,結(jié)果顯示具有較好的藥理活性,擬開發(fā)為治療缺血性腦中

4、風的藥物。本文研究了ND01對缺血性腦損傷的保護作用及腦缺血后的促血管新生作用,并探討了對缺血性腦損傷以及腦缺血后促血管新生的可能的作用機制。
　　一、ND01對缺糖和缺氧損傷的新生鼠皮層神經(jīng)元的保護作用
　　以培養(yǎng)的新生鼠皮層神經(jīng)元制備缺糖和缺氧損傷模型,觀察給予一定濃度的ND01對神經(jīng)元存活、線粒體抗氧化酶、線粒體呼吸酶和呼吸功能、細胞LDH漏出、細胞內(nèi)[Ca2+]j及凋亡的影響,結(jié)果表明給予濃度為3-81μM的ND01

5、對新生鼠皮層神經(jīng)元缺糖-缺氧損傷有明顯的保護作用,能明顯降低神經(jīng)元凋亡及壞死神經(jīng)元的百分率,減少LDH的漏出,抑制細胞[Ca2+]I水平的升高,改善線粒體能量代謝。
　　二、ND01對全腦缺血大鼠腦損傷的保護作用
　　結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈90分鐘,再通22.5 h,制備大鼠的全腦缺血再灌損傷模型,觀察靜脈注射給予ND01對全腦缺血大鼠腦損傷的神經(jīng)保護作用,結(jié)果表明ND0110 mg/kg、20 mg/kg靜脈給藥顯著降低全腦

6、缺血大鼠神經(jīng)細胞的壞死和凋亡,且具有明顯的劑量依賴關(guān)系。
　　三、ND01對大鼠局部腦缺血損傷的保護作用
　　線栓法制作大鼠中動脈栓塞模型,觀察靜脈注射給予ND01對大鼠中動脈栓塞導致的局部腦缺血大鼠腦損傷的神經(jīng)保護作用,結(jié)果表明ND0110 mg/kg、20 mg/kg靜脈注射給藥明顯減小局灶性腦缺血大鼠缺血24h和7天時的腦梗死面積,減輕神經(jīng)運動功能障礙,明顯減輕腦水腫程度。
　　四、ND01對大鼠腦缺血再灌損傷的

7、劑量.效應、治療時間窗及長期作用研究
　　線栓法制作大鼠中動脈栓塞模型,腦缺血1.5 h后再灌注,觀察靜脈注射ND01對大鼠腦缺血再灌損傷的劑量.效應、治療時間窗及長期作用。量效關(guān)系結(jié)果分析顯示,ND01單次靜脈注射超過10 mg/kg能夠顯著改善缺血導致的神經(jīng)行為缺陷,增加缺血區(qū)的腦神經(jīng)元存活數(shù)量;單次靜脈注射40 mg/kg以上改善缺血導致的神經(jīng)行為缺陷更顯著,缺血區(qū)的存活神經(jīng)元數(shù)量明顯多于10 mg/kg和20 mg/kg,

8、提示隨著ND01劑量的增加藥效明顯增強。治療時間窗分析顯示,再灌30 min、1 h、3 h、5 h后單次靜脈注射20 mg/kg能夠顯著改善缺血導致的神經(jīng)行為缺陷,增加缺血區(qū)的腦神經(jīng)元存活數(shù)量:但再灌7 h單次靜脈注射20 mg/kg不能改善缺血導致的神經(jīng)行為缺陷,缺血區(qū)的腦神經(jīng)元存活數(shù)量亦未明顯多于模型組,提示隨著時間延長,給予ND01藥效明顯減弱。長期治療作用分析顯示,再灌30min單次靜脈注射20 mg/kg能夠顯著改善造模第3

9、天、第7天和第14天缺血導致的神經(jīng)行為缺陷,增加缺血第14天時缺血區(qū)的腦神經(jīng)元存活數(shù)量,提示靜脈給予一定劑量的ND01具有明顯的長期神經(jīng)保護作用。
　　五、ND01對人臍靜脈內(nèi)皮細胞體外增殖、遷移及血管生成的作用
　　以人臍靜脈內(nèi)皮細胞為研究對象,SRB法測定細胞增殖,劃痕實驗檢測細胞遷移能力以及膠原基質(zhì)膠三維培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞檢測體外血管生成能力,結(jié)果給予濃度為9-81μM的ND01明顯增加人臍靜脈內(nèi)皮細胞細胞增殖能力和遷移能

10、力,另外血管樣結(jié)構(gòu)生成能力亦明顯增強。
　　六、ND01對局部腦缺血再灌大鼠血管新生的作用
　　栓線法制作大鼠中動脈栓塞再灌損傷模型,缺血24h后靜脈給予ND01,觀察ND01對缺血再灌大鼠促血管新生的作用,結(jié)果ND015 mg/kg、10 mg/kg靜脈給藥7天和14天明顯改善缺血再灌大鼠的神經(jīng)行為缺陷,促進缺血再灌大鼠缺血區(qū)的血管新生,增加再灌大鼠缺血區(qū)VEGF、Ang1和Tie2蛋白表達,同時增加缺血再灌大鼠缺血區(qū)磷酸

11、化Akt和磷酸化Tie2表達,而且未增加缺血再灌大鼠血腦屏障通透性,提示ND01促腦缺血大鼠血管新生可能通過PI3K/Akt信號通路。
　　結(jié)論:ND01對體外缺糖-缺氧損傷神經(jīng)元具有明顯的保護作用;對動物缺血性腦損傷具有明確的保護作用且具有明顯的劑量-效應關(guān)系、治療時間窗及長期作用,體內(nèi)和體外研究結(jié)果顯示均促進血管新生。抑制Ca2+超載和凋亡、改善線粒體能量代謝是ND01發(fā)揮其抗急性腦缺血的可能機制,通過PI3K/Akt信號通路