人源性同種異體去細(xì)胞周?chē)窠?jīng)的制備方法學(xué)與結(jié)構(gòu)組成成分的相關(guān)分析研究.pdf

1、本課題組在組織工程化周?chē)窠?jīng)方面作了許多研究，在SD大鼠和食蟹猴身上證實(shí)了經(jīng)過(guò)Triton X-100和Deoxycholate處理的同種異體神經(jīng)修復(fù)2cm以上的神經(jīng)缺損取得較為理想的效果。由于人體神經(jīng)與SD大鼠、猴相比相對(duì)粗大，并且神經(jīng)大小差異懸殊；人體神經(jīng)周?chē)Y(jié)締組織更豐富，經(jīng)過(guò)化學(xué)處理的時(shí)間和程序可能也需要作出相應(yīng)改變。目前文獻(xiàn)與本課題組研究均未涉及到人源性同種異體去細(xì)胞神經(jīng)材料的特殊性，故其制備方法的標(biāo)準(zhǔn)性必須對(duì)制備條件進(jìn)行重新

2、比較研究來(lái)予以確定，標(biāo)準(zhǔn)化的制備方法是進(jìn)行臨床生物安全性檢測(cè)與臨床驗(yàn)證之必不可少的路徑。并且目前所研究的去細(xì)胞同種異體去細(xì)胞神經(jīng)材料多是基于大鼠或獼猴的動(dòng)物模型材料，對(duì)于人源性材料，究竟其內(nèi)在結(jié)構(gòu)、組織成分、超微結(jié)構(gòu)有什么特點(diǎn)，其相應(yīng)的生物學(xué)行為相關(guān)性有哪些均為研究空白；而這些研究空白的填補(bǔ)，對(duì)于人體運(yùn)用時(shí)其生物安全性、有效性的評(píng)估，甚至作用機(jī)制的闡明均有積極和不可缺少的意義。 因此，本實(shí)驗(yàn)擬在本課題組以往實(shí)驗(yàn)和參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文

3、獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)采用不同流程處理新鮮截肢肢體取得的神經(jīng)，再對(duì)處理后神經(jīng)進(jìn)行大體、HE、Hoechst染色、免疫組化、TEM、電泳和蛋白測(cè)定等檢測(cè)，確定制備人源性去細(xì)胞同種異體神經(jīng)材料的標(biāo)準(zhǔn)工藝流程，為臨床神經(jīng)缺損的患者提供可促神經(jīng)再生的理想移植材料；并對(duì)按標(biāo)準(zhǔn)制備的不同規(guī)格的人源性去細(xì)胞神經(jīng)材料結(jié)構(gòu)差異性與殘留物安全性進(jìn)行比較研究，以利于臨床安全有效的應(yīng)用。 材料和方法： 1.不同化學(xué)萃取流程制備出人源性去細(xì)胞同種異體周

4、圍神經(jīng)材料并對(duì)其各項(xiàng)觀察指標(biāo)比較分析 1.1以人體神經(jīng)為材料，在本課題組以往實(shí)驗(yàn)和參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)各種不同流程，制備出人源性去細(xì)胞同種異體周?chē)窠?jīng)材料。 實(shí)驗(yàn)一共分為六組： 第一組：神經(jīng)組織PBS液泡洗2h→3％Triton X-100振蕩12h→PBS洗3次，每次5min→4％脫氧膽酸鈉振蕩24h→PBS洗3次，每次5min→上述步驟重復(fù)1次。 第二組：神經(jīng)組織PBS液泡洗2h→3％Tr

5、iton X-100振蕩24h→PBS洗3次，每次5min→4％脫氧膽酸鈉振蕩24h→PBS洗3次，每次5min→上述步驟重復(fù)1次。 第三組：神經(jīng)組織PBS液泡洗2h→3％Triton X-100振蕩24h→PBS洗3次，每次5min→4％脫氧膽酸鈉振蕩24h→PBS洗3次，每次5min。 第四組：神經(jīng)組織PBS液泡洗2h→3％Triton X-100振蕩12h→PBS洗3次，每次5min→4％脫氧膽酸鈉振蕩12h→PB

6、S洗3次，每次5min→上述步驟重復(fù)1次。 第五組：神經(jīng)組織PBS液泡洗2h→125mM SB-10振蕩15h→PBS洗3次，每次5min→0.6 mM SB-16 and0.14％Triton X—200振蕩24h→PBS洗3次，每次5min→上述步驟重復(fù)一次。 第六組：未萃取的新鮮神經(jīng)作為對(duì)照。 1.2對(duì)制備的上述人源性去細(xì)胞同種異體周?chē)窠?jīng)材料進(jìn)行各種檢測(cè)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定結(jié)構(gòu)保存和細(xì)胞成分去除綜合起來(lái)

7、最合適的標(biāo)準(zhǔn)流程。 觀察指標(biāo)： (1)大體形態(tài)： Fontana橫紋，大小，塌陷程度。 (2)HE染色和細(xì)胞核染色(Hoechst染色)：了解雪旺細(xì)胞殘留程度及神經(jīng)大體結(jié)構(gòu)的完整性。 (3)免疫組化：anti—laminin反映基底膜；anti—collagenⅠ了解神經(jīng)內(nèi)膜完整性；anti—neurofilament反映軸突；anti—S-100反映雪旺細(xì)胞。 (4)髓磷脂堿性蛋白(MBP)測(cè)定

8、：Western免疫印跡法。 (5)凱氏定氮法測(cè)定制備的人源性去細(xì)胞同種異體神經(jīng)材料的蛋白比例。 (6)TEM觀察了解基底膜結(jié)構(gòu)完整及軸突和雪旺細(xì)胞、髓鞘殘留程度。 2.標(biāo)準(zhǔn)制備的不同規(guī)格的人源性去細(xì)胞神經(jīng)材料結(jié)構(gòu)差異性與殘留物安全性進(jìn)行比較研究。 2.1不同規(guī)格的人源性去細(xì)胞同種異體周?chē)窠?jīng)材料經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)萃取流程制備后的結(jié)果分析。 把人體神經(jīng)依據(jù)粗細(xì)分為1.5±0.5cm和5.0±1.0cm

9、兩組，長(zhǎng)度均為2cm，均經(jīng)過(guò)第一部分中確定的標(biāo)準(zhǔn)萃取流程處理，制備成人源性去細(xì)胞同種異體神經(jīng)材料。 將制備的材料分別進(jìn)行HE和Hoechst染色、免疫組化(包括LN、NF、S-100和ColⅠ)以及TEM觀察，比較其基底膜結(jié)構(gòu)的保存完整性和雪旺細(xì)胞、軸突去除的程度。 2.2人源性去細(xì)胞同種異體周?chē)窠?jīng)材料制備后清洗液量和次數(shù)對(duì)萃取劑殘留濃度的比較。 選取一組制備材料，分別用神經(jīng)與清洗液體積比為1:100和1:30

10、0的PBS液沖洗5遍，每遍留取5ml作MS、LC/MS測(cè)定萃取劑(Triton X-100和脫氧膽酸鈉)殘留濃度。 結(jié)果： 1.萃取后的各組神經(jīng)其直徑和長(zhǎng)度均稍大于化學(xué)萃取前的新鮮神經(jīng)，顏色呈乳白色半透明狀，神經(jīng)大體輪廓仍完整，質(zhì)地較前疏松，神經(jīng)外膜白色條紋結(jié)構(gòu)消失；在空氣中無(wú)塌陷，較易粘著；牽拉各種方法制備去細(xì)胞同種異體神經(jīng)，其延展性均較化學(xué)萃取前略增加。其中第二組大體較其它組結(jié)構(gòu)更疏松，韌彈性稍差，可在無(wú)張力下行常規(guī)

11、的神經(jīng)吻合。 2.HE和Hoechst染色可見(jiàn)第二組髓鞘和細(xì)胞核去除最徹底，其它各組去除均有不同程度的殘留。其中萃取一次組殘留最多，Triton X—200組仍殘留髓鞘和細(xì)胞核碎片位于萃取一次組、萃取12h組之間。 3.免疫組化可見(jiàn)經(jīng)過(guò)萃取的各組切片均有不同程度的脫片現(xiàn)象，全部六組中LN和ColⅠ染色都呈陽(yáng)性，第二組可見(jiàn)基底膜結(jié)構(gòu)稍欠完整；第一、二組NF和S-100染色均陰性，萃取一次組、萃取12h組、Triton X—

12、200組有陽(yáng)性表現(xiàn)，萃取一次組陽(yáng)性尤其明顯。 4.MBP電泳見(jiàn)萃取一次組、萃取12h組仍有髓磷脂堿性蛋白殘留，其余各萃取組未見(jiàn)明顯MBP條帶。 5.TEM可見(jiàn)第二組萃取最干凈且基底膜保持完整，與其它萃取組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；萃取一次組、萃取12h組、Triton X—200組基底膜完整，有髓鞘和細(xì)胞碎片存留，尤以萃取一次組存留最多；對(duì)照組神經(jīng)結(jié)構(gòu)正常。 6.凱氏定氮法顯示萃取制備的各組人源性去細(xì)胞同種異體神經(jīng)中，第一組

13、為7.1％，第二組為6.5％，萃取一次組為10.9％，萃取12h組為8.4％，Triton X—200組為9.1％，對(duì)照組為13.1％。其中第二組中蛋白比例最低，表示其雪旺細(xì)胞和軸突成分去除最徹底。 7.不同規(guī)格的人源性去細(xì)胞周?chē)窠?jīng)材料經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)萃取流程處理后，其HE、Hoechst染色、免疫組化包括LN、NF、S-100、ColⅠ染色以及透射電鏡觀察，其神經(jīng)形態(tài)的完整性和雪旺細(xì)胞、軸突去除干凈程度未見(jiàn)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

14、 8.PBS清洗液與制備萃取好的神經(jīng)體積比1:300比其比值為1:100更能降低Triton X-100和Deoxycholate的殘留濃度，兩種體積比之間可見(jiàn)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論： 1.經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)萃取處理程序，人源性同種異體周?chē)窠?jīng)可獲得生物物理性狀與外科縫合條件下大致可滿足臨床修復(fù)的脫細(xì)胞支架材料。 2.此種脫細(xì)胞材料在經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚碇?，可保持基底膜結(jié)構(gòu)的完整，已幾乎不殘留細(xì)胞與髓鞘成分。組織內(nèi)示意

15、蛋白含量的氮含量最大降低量超過(guò)50％(13.1-6.5)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究提供了完整的組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、透射電鏡和蛋白電泳及氮含量測(cè)定的依據(jù)。 3.據(jù)現(xiàn)有研究資料可以認(rèn)為上述檢測(cè)指標(biāo)可作為確定適當(dāng)或理想的化學(xué)萃取制備工藝流程的質(zhì)量控制指標(biāo)，而能達(dá)到此質(zhì)量控制指標(biāo)的流程可設(shè)計(jì)為生產(chǎn)可供臨床試用產(chǎn)品的企業(yè)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，(事實(shí)上我們此標(biāo)準(zhǔn)流程已獲中國(guó)藥品生物制品檢定所批準(zhǔn)為企業(yè)送檢合格產(chǎn)品之生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn))。 4.本研究確認(rèn)的制備人源

16、性同種異體神經(jīng)去細(xì)胞支架材料的標(biāo)準(zhǔn)方法流程為：神經(jīng)無(wú)菌PBS液泡洗2h→3％ Triton X-100振蕩24h→PBS沖洗3遍，每遍5min→4％脫氧膽酸鈉液振蕩24h→PBS沖洗3遍，每遍5min→3％ Triton X-100振蕩24h→PBS沖洗3遍，每遍5min→4％脫氧膽酸鈉液振蕩24h→PBS沖洗3遍，每遍5min→PBS液(含100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素)中0-4℃保存?zhèn)溆? 5.經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)流程制備