新型國(guó)產(chǎn)光敏劑葉綠酸f介導(dǎo)的光動(dòng)力作用膀胱癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、新型國(guó)產(chǎn)光敏劑葉綠酸f介導(dǎo)的光動(dòng)力作用膀胱癌的實(shí)驗(yàn)研究研究目的葉綠酸f是由本課題組最近研制開發(fā)的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型光敏劑，其基本的光動(dòng)力學(xué)特性以及對(duì)膀胱癌的光動(dòng)力殺傷效果和機(jī)制尚不清楚。
　　目的：明確葉綠酸f的制備流程及其光動(dòng)力學(xué)特性，探討其介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)作用對(duì)膀胱癌細(xì)胞的體外殺傷效果及其可能的機(jī)制，為其下一步的臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)理論支持。
　　方法：1、首先從原料中藥蠶砂中提取得到葉綠素粗制品，經(jīng)堿水解、分離、提

2、取、純化等步驟得到純度極高的葉綠酸e6，再由葉綠酸e6制備葉綠酸f以及其對(duì)應(yīng)的鈉鹽。2、采用質(zhì)譜儀(Mass spectrometry, MS)分析葉綠酸f分子量，高壓液相色譜(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分析葉綠酸f樣品的純度，熒光分光光度計(jì)分析其吸收光譜，應(yīng)用1，3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)檢測(cè)其產(chǎn)生1O2的能力。3、體外培養(yǎng)膀胱癌5637和T24細(xì)胞到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然

3、后應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)不同濃度的葉綠酸f在不同能量密度的650nm波長(zhǎng)激光激發(fā)下對(duì)膀胱癌5637和T24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，倒置顯微鏡下觀測(cè)膀胱癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。4、將葉綠酸f與5637和T24細(xì)胞孵育4h后，再用線粒體特異性探針標(biāo)記線粒體，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope，CLSM)檢測(cè)葉綠酸f在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞分布;對(duì)葉綠酸f光動(dòng)力學(xué)治療(Photodynamic thera

4、py, PDT)12h后的5637和T24細(xì)胞應(yīng)用DAPI染色，熒光顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變;采用流式細(xì)胞儀(Flowcytometry, FCM)分析葉綠酸f光動(dòng)力學(xué)處理12h后5637和T24細(xì)胞的凋亡率。5、采用細(xì)胞凋亡蛋白抗體芯片技術(shù)檢測(cè)5637和T24細(xì)胞光動(dòng)力處理前后bad、bax、BID、BIM、Bcl-2、Bcl-w、Caspase-3、Caspase-8和細(xì)胞色素C、XIAP、SMAC等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，探討

5、葉綠酸f光動(dòng)力學(xué)作用誘導(dǎo)5637和T24細(xì)胞凋亡的可能機(jī)理。6、將葉綠酸f與5637和T24細(xì)胞孵育2h后，應(yīng)用溶酶體特異性探針標(biāo)記溶酶體，激光共聚焦顯微鏡下觀測(cè)葉綠酸f在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞分布;westemblot方法檢測(cè)葉綠酸f光動(dòng)力學(xué)處理前后5637和T24細(xì)胞中LC3，Beclin1蛋白的表達(dá)情況;分別應(yīng)用Cyto-ID?自噬特異性染料、單丹磺酰戊二胺(Monodansylcadaverin，MDC)、吖啶橙（Acridine Or

6、ange，AO）染料對(duì)葉綠酸f光動(dòng)力學(xué)處理后的5637和T24細(xì)胞進(jìn)行染色，然后激光共聚焦顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變;透射電鏡(Transmission Electron Microscope，TEM)下觀察葉綠酸f光動(dòng)力學(xué)處理1h后5637和T24細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。7、應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)對(duì)5637和T24細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理1h，然后給與f-PDT處理，分別采用CCK-8法以及流式細(xì)

7、胞儀分析葉綠酸f光動(dòng)力學(xué)處理后5637和T24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率和凋亡率。
　　結(jié)果：1、制得的葉綠酸f樣品純度為90.19％，相對(duì)分子量為539.3，其吸收峰為653.5nm，599.0nm，501.5nm以及398.5nm，其中398.5nm和653.5nm處吸收峰最強(qiáng);葉綠酸f與DPBF溶液共孵育后，采用波長(zhǎng)為405nm，能量密度為40mW/cm2的紅光分別激發(fā)15s，30s，45s，60，75s，熒光光譜儀結(jié)果顯示DPBF的

8、熒光強(qiáng)度隨著激光激發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降。2、葉綠酸f各濃度1、2和4ug/ml對(duì)5637細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率在4J/cm2下分別為33.92％、57.38％和84.88％，在2J/cm2則相應(yīng)為25.4％、51.21％和70.09％，各濃度2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml對(duì)T24細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率在4J/cm2下分別為34.03％、60.11％和86.51％，在2J/cm2為31.79％、53.83％和72.89％。3、5637和

9、T24細(xì)胞先后與葉綠酸f，線粒體探針孵育后，激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示400nm激發(fā)葉綠酸f發(fā)出的紅色熒光與488nm激發(fā)線粒體探針產(chǎn)生的綠色熒光分布基本一致。4、熒光顯微鏡下DAPI染色結(jié)果可見f-PDT處理后5637和T24細(xì)胞均出現(xiàn)胞核邊緣不規(guī)則，核固縮，核溶解、碎裂，核小體碎片增加等細(xì)胞凋亡的典型特征，而空白對(duì)照組細(xì)胞則未見到明顯的凋亡細(xì)胞。5、5637細(xì)胞在4ug/ml葉綠酸f和4J/cm2激光條件下，光動(dòng)力處理后，行流式細(xì)胞檢

10、測(cè)，細(xì)胞凋亡率為50.61±1.66％，細(xì)胞對(duì)照組凋亡率為4.05±0.12％; T24細(xì)胞在10ug/ml葉綠酸f和4J/cm2激光條件下，光動(dòng)力處理后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率為54.3±1.32％，細(xì)胞對(duì)照組凋亡率為11.31±0.71％。兩種細(xì)胞中PDT處理組與細(xì)胞對(duì)照組之間差異有顯著性意義(P＜0.01)。6、在5637細(xì)胞PDT處理組中促凋亡蛋白bad、BID、BIM較對(duì)照組有不同程度的升高，分別為對(duì)照組的1.25倍，1.

11、38倍和1.23倍;而抗凋亡蛋白Bcl-2與Bcl-w相較于對(duì)照組則有明顯的下降，分別為對(duì)照組的0.25倍和0.48倍;處理組細(xì)胞色素C水平高于對(duì)照組，是對(duì)照組的1.32倍;Caspase3相較于處理組也有一定程度的升高，為對(duì)照組的1.35倍，Caspase8則相對(duì)于對(duì)照組無明顯改變;凋亡抑制蛋白XIAP處理組明顯低于對(duì)照組，是對(duì)照組的0.34倍;促凋亡蛋白SMAC處理組則高于對(duì)照組，為對(duì)照組的1.14倍。在T24細(xì)胞處理組中促凋亡蛋白

12、bad、bax、BID、BIM較對(duì)照組有不同程度的升高，分別為對(duì)照組的2.39倍，1.55倍，2.06倍和1.19倍;而抗凋亡蛋白Bcl-2與Bcl-w相較于對(duì)照組均有一定程度的下降，分別為對(duì)照組的0.83和0.82倍;處理組細(xì)胞色素C水平高于對(duì)照組，是對(duì)照組的1.55倍;Caspase3和Caspase8處理組對(duì)比對(duì)照組均有一定程度的升高，分別為對(duì)照組的1.42倍和1.18倍;凋亡抑制蛋白XIAP處理組低于對(duì)照組，是對(duì)照組的0.82倍

13、;促凋亡蛋白SMAC處理組高于對(duì)照組，為對(duì)照組的1.35倍。7、兩種細(xì)胞與葉綠酸f孵育2h后，再與溶酶體探針孵育，激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示葉綠酸f自身的紅色熒光與504nm激發(fā)溶酶體探針產(chǎn)生的綠色熒光分布基本一致。8、Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白在5637和T24細(xì)胞PDT處理組中表達(dá)增高，均呈一定的時(shí)間依賴性。9、Cyto-ID?自噬特異性綠色染料，MDC以及AO染色后，激光共聚焦結(jié)果顯示5637和T24細(xì)胞內(nèi)在f-PDT后1h，2

14、h和4h均先后形成自噬體(autophagosomes)，晚期自噬體以及自噬溶酶體(autolysosomes)結(jié)構(gòu)。10、5637和T24細(xì)胞光動(dòng)力學(xué)處理后，透射電鏡檢測(cè)顯示細(xì)胞內(nèi)很多雙層膜樣結(jié)構(gòu)的自噬體，其內(nèi)部可見到胞質(zhì)成分以及受損的細(xì)胞器。對(duì)照組無相應(yīng)改變。11、3-MA預(yù)處理+PDT處理組中5637細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為93.52％，而對(duì)應(yīng)的PDT處理組中5637細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率則為83.15％，3-MA對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為6.7

15、3％;同時(shí)3-MA預(yù)處理+PDT處理組中T24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為95.51％，對(duì)應(yīng)的T24細(xì)胞PDT處理組中的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為86.19％，3-MA對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率則為5.78％。12、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，3-MA預(yù)處理+PDT處理組中5637細(xì)胞的凋亡率69.45±2.14％，而對(duì)應(yīng)的PDT處理組中5637細(xì)胞的凋亡率則為50.61±1.66％;同時(shí)3-MA預(yù)處理+PDT處理組中T24細(xì)胞的凋亡率為77.69±1.75，對(duì)應(yīng)的T2

16、4細(xì)胞PDT處理組中的細(xì)胞凋亡率為54.3±1.32％。兩種細(xì)胞中3-MA預(yù)處理+PDT處理組與PDT處理組之間差異有顯著性意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：1、制備的葉綠酸f純度高，光學(xué)特性符合理想光敏劑要求。2、葉綠酸f結(jié)合650nm激光，體外光動(dòng)力作用殺傷膀胱癌5637和T24效果顯著，具有藥物劑量和激光能量依賴性。3、葉綠酸f可以定位在膀胱癌細(xì)胞溶酶體以及線粒體中，首先誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生自噬，然后通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤