細(xì)胞因子對(duì)人冠脈平滑肌細(xì)胞PAPP-A、MMP-3、TIMP-1、CD40L基因表達(dá)的影響.pdf

1、背景：急性冠脈綜合征涵蓋了從不穩(wěn)定性心絞痛到冠脈性猝死的一系列臨床急癥，常起病突然，危險(xiǎn)性極大，大量研究表明炎癥在急性冠脈綜合征發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。急性冠脈綜合征的發(fā)生和不穩(wěn)定斑塊的破裂有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)、妊娠相關(guān)血漿蛋白-A

2、(pregnancy-associated plasma protein-A，PAPP-A)、CD40L等血清標(biāo)志物與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)，在斑塊從穩(wěn)定轉(zhuǎn)向不穩(wěn)定的過程中起著非常重要的作用。血管平滑肌細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中重要的細(xì)胞成分，在整個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程中占有重要地位，它不僅在結(jié)構(gòu)上促成了動(dòng)脈粥樣硬化及狹窄形成，同時(shí)還具有重要的局部旁分泌功能，參與斑塊發(fā)展的病理生理過程。研究表明在人成骨細(xì)胞、人皮成纖維細(xì)胞中上述血清標(biāo)志物表達(dá)

3、受細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)參與炎癥反應(yīng)過程，但在人冠脈平滑肌細(xì)胞上尚沒有相應(yīng)的研究報(bào)道，因此，我們假設(shè)在人冠脈平滑肌細(xì)胞上也有類似的調(diào)控機(jī)制。 目的：研究細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、α-干擾素(interferon-α，IFN-α)對(duì)人冠脈平滑肌細(xì)胞中PAPP-A、MMP-3、TIMP-1、CD40L基因表達(dá)的影響，探討炎癥因素在急性冠脈綜合

4、征中的作用機(jī)制。 方法：人冠脈平滑肌細(xì)胞在37℃，95％空氣和5％CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用5-7代細(xì)胞。細(xì)胞按1×10<'4>/cm<'2>密度接種于25cm<'2>培養(yǎng)瓶中，24小時(shí)后換液，培養(yǎng)48小時(shí)后細(xì)胞接近80％融合時(shí)加入細(xì)胞因子進(jìn)行刺激。1．應(yīng)用20ug/LIL-1β、10ug/LIL-6、20ug/LIFN-α各自刺激人冠脈平滑肌細(xì)胞，在共同培養(yǎng)0、2、4、8、24、36h后收集細(xì)胞及上清夜，觀察細(xì)胞因子的時(shí)

5、間效應(yīng)。2．應(yīng)用不同濃度的IL-1β(0、5、20、40ug/L)、IL-6(0、5、10、50ugL)、IFN-α(0、5、20、40ug/L)刺激人冠脈平滑肌細(xì)胞，共同培養(yǎng)6h后收集細(xì)胞及上清夜，觀察細(xì)胞因子的劑量效應(yīng)。3．上清液-70℃凍存，細(xì)胞用生理鹽水沖洗兩遍后用TRIzol消化、提取總RNA。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP-3、TIMP-1、PAPP-A、CD40L基因表達(dá)量。所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)描述與分析，計(jì)量資料用x±s表示，多組間比較用one-way ANOVA檢驗(yàn)，兩兩比較應(yīng)用SNK法檢驗(yàn)，并進(jìn)行spearman相關(guān)分析，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：同劑量IL-1β刺激下，MMP-3和PAPP-A基因表達(dá)量在2h時(shí)開始發(fā)生上調(diào)，8h左右達(dá)高峰，而后開始下降；而TIMP-1表達(dá)量在2h時(shí)開始發(fā)生下降，8h左右達(dá)最低，而后開始上升。在不同劑量IL-1β刺激下，MMP-3、PAPP-A基因表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)

7、劑量范圍內(nèi)隨著劑量加大呈上升趨勢(shì)(MMP-3：r=0.907，p=0.000；PAPP-A：r=0.972，p=0.000)，TIMP-1呈下降趨勢(shì)(r=-0.768，p=0.004)。不同劑量組MMP-3、TIMP-1、PAPP-A表達(dá)量具有顯著性差異(MMP-3：F=24.047，P=0.000：TIMP-1:F=33.737，P=0.000；PAPP-A：F=264.699，P=0.000)。MMP-3在20μg/L和40μg/L

8、組間基因的表達(dá)量沒有顯著性差異(p=0.154)，其余各組間均有顯著性差異；TIMP-1的表達(dá)量在僅40μg/L組和其他組別之間具有顯著性差異，其余組間無顯著性差異(p=0.383)；PAPP-A的表達(dá)量在各組間均有顯著性差異。 在同劑量IL-6刺激下，MMP-3、PAPP-A表達(dá)量的時(shí)間變化趨勢(shì)和IL-1β相似，而TIMP-1則在4h時(shí)就達(dá)到最低，隨后開始上升。在不同劑量IL-6刺激下，MMP-3、PAPP-A亦有隨劑量加大表

9、達(dá)量上升的趨勢(shì)(MMP-3：r=0.919，p=0.000；PAPP-A：r=0.941，p=0.000)，TIMP-1呈下降趨勢(shì)(r=-0.799，p=0.002)。不同劑量組MMP-3、TIMP-1、PAPP-A的表達(dá)量均具有顯著性差異(MMP-3：F=14.081，P=0.001；TIMP-1:F=5.727，P=0.022；PAPP-A：F=25.128，P=0.000)。MMP-3基因在5μg/L和10μg/L組間的表達(dá)量沒有

10、顯著性差異(p=0.292)；TIMP-1對(duì)照組與10μg/L和50μg/L組間具有顯著性差異，其余各組間均沒有顯著性差異(p=0.253)；PAPP-A基因的表達(dá)量在5 ug/L和10 ug/L組沒有顯著性差異(p=0.065)，其余各組間均有顯著性差異。在IFN-α的刺激下，MMP-3、PAPP-A基因表達(dá)量是先下降，在8h左右達(dá)最低，而后開始上升；TIMP-1則是先上升，在8h左右達(dá)高峰，而后呈下降趨勢(shì)。在不同劑量IFN-α刺激下

11、，MMP-3、PAPP-A基因表達(dá)量隨刺激劑量加大呈下降趨勢(shì)(MMP-3：r=-0.928，p=0.000；PAPP-A：r=-0.919，p=0.000)，而TIMP-1則呈上升趨勢(shì)(r=0.864，p=0.000)。不同劑量組MMP-3、TIMP-1、PAPP-A表達(dá)量均有顯著性差異(MMP-3：F=23.849，P=0.000；TIMP-1:F=49.526，P=0.000；PAPP-A：F=70.822，P=0.000)。MMP

12、-3在0μg/L和5μg/L組之間沒有顯著性差異(p=0.097)；TIMP-1在5μg/L和20μg/L組間沒有顯著性差異(p=0.597)；PAPP-A在20μg/L和40μg/L組之間沒有顯著性差異(p=0.783)，其余組間均有顯著性差異。 在三種細(xì)胞因子刺激下，CD40L表達(dá)量沒有顯著變化趨勢(shì)，不同劑量組間表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：細(xì)胞因子可能通過對(duì)冠脈平滑肌細(xì)胞中斑塊穩(wěn)定相關(guān)標(biāo)記物PAPP-A、MMP-3、