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文檔簡介
1、背景:急性冠脈綜合征涵蓋了從不穩(wěn)定性心絞痛到冠脈性猝死的一系列臨床急癥,常起病突然,危險性極大,大量研究表明炎癥在急性冠脈綜合征發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。急性冠脈綜合征的發(fā)生和不穩(wěn)定斑塊的破裂有關(guān),研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)、妊娠相關(guān)血漿蛋白-A
2、(pregnancy-associated plasma protein-A,PAPP-A)、CD40L等血清標志物與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān),在斑塊從穩(wěn)定轉(zhuǎn)向不穩(wěn)定的過程中起著非常重要的作用。血管平滑肌細胞是動脈粥樣硬化斑塊中重要的細胞成分,在整個動脈粥樣硬化的進程中占有重要地位,它不僅在結(jié)構(gòu)上促成了動脈粥樣硬化及狹窄形成,同時還具有重要的局部旁分泌功能,參與斑塊發(fā)展的病理生理過程。研究表明在人成骨細胞、人皮成纖維細胞中上述血清標志物表達
3、受細胞因子的調(diào)節(jié)參與炎癥反應(yīng)過程,但在人冠脈平滑肌細胞上尚沒有相應(yīng)的研究報道,因此,我們假設(shè)在人冠脈平滑肌細胞上也有類似的調(diào)控機制。 目的:研究細胞因子白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、α-干擾素(interferon-α,IFN-α)對人冠脈平滑肌細胞中PAPP-A、MMP-3、TIMP-1、CD40L基因表達的影響,探討炎癥因素在急性冠脈綜合
4、征中的作用機制。 方法:人冠脈平滑肌細胞在37℃,95%空氣和5%CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗用5-7代細胞。細胞按1×10<'4>/cm<'2>密度接種于25cm<'2>培養(yǎng)瓶中,24小時后換液,培養(yǎng)48小時后細胞接近80%融合時加入細胞因子進行刺激。1.應(yīng)用20ug/LIL-1β、10ug/LIL-6、20ug/LIFN-α各自刺激人冠脈平滑肌細胞,在共同培養(yǎng)0、2、4、8、24、36h后收集細胞及上清夜,觀察細胞因子的時
5、間效應(yīng)。2.應(yīng)用不同濃度的IL-1β(0、5、20、40ug/L)、IL-6(0、5、10、50ugL)、IFN-α(0、5、20、40ug/L)刺激人冠脈平滑肌細胞,共同培養(yǎng)6h后收集細胞及上清夜,觀察細胞因子的劑量效應(yīng)。3.上清液-70℃凍存,細胞用生理鹽水沖洗兩遍后用TRIzol消化、提取總RNA。應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)MMP-3、TIMP-1、PAPP-A、CD40L基因表達量。所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.0軟件包進行
6、統(tǒng)計學(xué)描述與分析,計量資料用x±s表示,多組間比較用one-way ANOVA檢驗,兩兩比較應(yīng)用SNK法檢驗,并進行spearman相關(guān)分析,p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果:同劑量IL-1β刺激下,MMP-3和PAPP-A基因表達量在2h時開始發(fā)生上調(diào),8h左右達高峰,而后開始下降;而TIMP-1表達量在2h時開始發(fā)生下降,8h左右達最低,而后開始上升。在不同劑量IL-1β刺激下,MMP-3、PAPP-A基因表達量在實驗
7、劑量范圍內(nèi)隨著劑量加大呈上升趨勢(MMP-3:r=0.907,p=0.000;PAPP-A:r=0.972,p=0.000),TIMP-1呈下降趨勢(r=-0.768,p=0.004)。不同劑量組MMP-3、TIMP-1、PAPP-A表達量具有顯著性差異(MMP-3:F=24.047,P=0.000:TIMP-1:F=33.737,P=0.000;PAPP-A:F=264.699,P=0.000)。MMP-3在20μg/L和40μg/L
8、組間基因的表達量沒有顯著性差異(p=0.154),其余各組間均有顯著性差異;TIMP-1的表達量在僅40μg/L組和其他組別之間具有顯著性差異,其余組間無顯著性差異(p=0.383);PAPP-A的表達量在各組間均有顯著性差異。 在同劑量IL-6刺激下,MMP-3、PAPP-A表達量的時間變化趨勢和IL-1β相似,而TIMP-1則在4h時就達到最低,隨后開始上升。在不同劑量IL-6刺激下,MMP-3、PAPP-A亦有隨劑量加大表
9、達量上升的趨勢(MMP-3:r=0.919,p=0.000;PAPP-A:r=0.941,p=0.000),TIMP-1呈下降趨勢(r=-0.799,p=0.002)。不同劑量組MMP-3、TIMP-1、PAPP-A的表達量均具有顯著性差異(MMP-3:F=14.081,P=0.001;TIMP-1:F=5.727,P=0.022;PAPP-A:F=25.128,P=0.000)。MMP-3基因在5μg/L和10μg/L組間的表達量沒有
10、顯著性差異(p=0.292);TIMP-1對照組與10μg/L和50μg/L組間具有顯著性差異,其余各組間均沒有顯著性差異(p=0.253);PAPP-A基因的表達量在5 ug/L和10 ug/L組沒有顯著性差異(p=0.065),其余各組間均有顯著性差異。在IFN-α的刺激下,MMP-3、PAPP-A基因表達量是先下降,在8h左右達最低,而后開始上升;TIMP-1則是先上升,在8h左右達高峰,而后呈下降趨勢。在不同劑量IFN-α刺激下
11、,MMP-3、PAPP-A基因表達量隨刺激劑量加大呈下降趨勢(MMP-3:r=-0.928,p=0.000;PAPP-A:r=-0.919,p=0.000),而TIMP-1則呈上升趨勢(r=0.864,p=0.000)。不同劑量組MMP-3、TIMP-1、PAPP-A表達量均有顯著性差異(MMP-3:F=23.849,P=0.000;TIMP-1:F=49.526,P=0.000;PAPP-A:F=70.822,P=0.000)。MMP
12、-3在0μg/L和5μg/L組之間沒有顯著性差異(p=0.097);TIMP-1在5μg/L和20μg/L組間沒有顯著性差異(p=0.597);PAPP-A在20μg/L和40μg/L組之間沒有顯著性差異(p=0.783),其余組間均有顯著性差異。 在三種細胞因子刺激下,CD40L表達量沒有顯著變化趨勢,不同劑量組間表達量無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論:細胞因子可能通過對冠脈平滑肌細胞中斑塊穩(wěn)定相關(guān)標記物PAPP-A、MMP-3、
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