Dickkopf1對人血管平滑肌細(xì)胞功能影響及與急性冠脈綜合征血清因子的關(guān)系.pdf

1、研究背景：
　　急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerosis heart disease，CAD)中的急性臨床事件，包括非ST段抬高型ACS(non-ST-segment acute coronary syndrome，NST-ACS)和急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial i

2、nfarction，STEMI)，前者又包括不穩(wěn)定型心絞痛(unstable angina，UA)和急性非ST段抬高型心肌梗死(non-ST-segment elevation myocardial infarction, NSTEMI)。
　　冠狀動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊的破裂、潰爛或糜爛引起動(dòng)脈內(nèi)血栓的形成以及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊負(fù)荷增加共同成為ACS主要的病理生理機(jī)制。氧化低密度脂蛋白（oxidi

3、zed low-density lipoprotein，ox-LDL）是動(dòng)脈粥樣硬化的主要病理因素，可影響血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的功能。
　　Dickkopf1(DKK1)通過抑制經(jīng)典Wnt通路參與胚胎發(fā)育、多種疾病的發(fā)生等生物過程。研究證實(shí)，STEMI患者外周血DKK1濃度升高，DKK1可能用于預(yù)測ACS患者再次發(fā)生不良心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。DKK1還可參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過程中血小板與內(nèi)皮細(xì)胞間的炎癥反應(yīng)

4、，介導(dǎo)震蕩剪切力作用下血管單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附功能，參與巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)的吞噬和內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡等。但目前尚不清楚DKK1是否影響動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中血管平滑肌細(xì)胞的功能。
　　纖溶酶原激活物抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI1）可通過抑制纖維蛋白降解，間接促血栓形成，參員與AMI的病理改變;組織因子(tissuefactor，TF)是參與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要成員，也可參與AMI

5、患者冠狀動(dòng)脈血栓的形成。
　　白細(xì)胞介素-17(interlukin-17，IL-17)和白細(xì)胞介素-1β(interlukin-1β，IL-1β)被證實(shí)可參與動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)。
　　而DKK1同樣作為參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的分子，其在此過程中與ACS血清因子PAI1、TF、IL-17、IL-1β的相關(guān)性如何尚不清楚。
　　目的：
　　1.在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，觀察DKK1對人血管平滑肌細(xì)胞功能的影響。
　

6、　2.在臨床研究中，探討DKK1與急性冠脈綜合征血清因子PAI1、TF、IL-17、IL-1β的相關(guān)性。
　　方法：
　　1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　選擇狀態(tài)良好的8-10代人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human aortic smooth musclecells，HASMCs)用于實(shí)驗(yàn)，設(shè)置三組ox-LDL濃度梯度，分別為50、100、150ug/ml，每組ox-LDL刺激HASMCs0、3、6、12、24h后，檢測DKK1蛋白或mR

7、NA表達(dá)水平。
　　設(shè)置Negative Control(NC)組、NC+ox-LDL刺激組、DKK1 siRNA刺激組、DKK1 siRNA+ox-LDL刺激組和DKK1過表達(dá)組。收集細(xì)胞總蛋白，western blot檢測DKK1、collagenⅢ、P4Hα1、MMP-2、MMP-9和PCNA的表達(dá)水平;EdU增殖實(shí)驗(yàn)檢測各組HASMCs增殖水平。
　　2.臨床實(shí)驗(yàn)
　　按照入組標(biāo)準(zhǔn)，收集2017年1月至2017

8、年3月于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院心內(nèi)科和急診心內(nèi)科住院治療的ACS患者，將其分為UA組和AMI組，以及于健康體檢中心查體的正常對照。采集入選者空腹血，并收集完整住院病歷或體檢信息。用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linked immunnosorbent assay，ELISA)檢測各樣本血漿DKK1、PAI1、TF、IL-17和IL-1β的濃度。
　　3.統(tǒng)計(jì)方法
　　使用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析:運(yùn)用單因素方差分析檢測多

9、組數(shù)據(jù)組間差異，Pearson直線相關(guān)分析和Spearman直線相關(guān)分析檢測數(shù)據(jù)相關(guān)性，受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）初步分析診斷敏感度和特異度，顯著性水平p值＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　(1) ox-LDL上調(diào)HASMCs中DKK1的表達(dá)
　　Western blot結(jié)果顯示，與空白對照相比，

10、100 ug/ml ox-LDL刺激HASMCs12h后，DKK1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(p＜0.01); RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對照相比，100 ug/ml ox-LDL刺激HASMCs3h后，DKK1 mRNA表達(dá)增加(p＜0.05)。(2) DKK1影響HASMCs的膠原代謝
　　Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比，ox-LDL刺激HASMCs或DKK1過表達(dá)后，HASMCs中collagenⅢ、P4Hα1、MM

11、P-2和MMP-9蛋白表達(dá)均上調(diào)(p＜0.05);與NC組相比，siRNA干擾DKK1表達(dá)后，MMP-2表表達(dá)顯著下調(diào)(p＜0.01)。在ox-LDL刺激下，siRNA干擾DKK1的表達(dá)可減少collagenⅢ、P4HαI、MMP-2和MMP-9的表達(dá)(p＜0.01)。
　　(3) DKK1影響HASMCs的增殖
　　EdU染色實(shí)驗(yàn)顯示，與NC組相比，ox-LDL刺激或過表達(dá)DKK1可促進(jìn)HASMCs增殖(p＜0.01);干

12、擾DKK1的表達(dá)，HASMCs增殖減少(p＜0.01)。
　　Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比，ox-LDL和DKK1過表達(dá)均可誘導(dǎo)HASMCs中PCNA蛋白表達(dá)升高(p＜0.05)，抑制DKK1表達(dá)后，HASMCs中PCNA表達(dá)下調(diào)(p＜0.05)。
　　2.臨床研究結(jié)果
　　(1)正常對照組、UA組和AMI組的基本信息和血清檢查結(jié)果組間比較
　　與正常對照組相比，UA組和AMI組患者年齡和血清甘

13、油三酯(TG)、肌酐(Cr)濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，UA組和AMI組患者血清高密度膽固醇脂蛋白(HDL-C)濃度顯著降低(p＜0.05)，AMI組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)顯著升高(p＜0.01)。與UA組相比，AMI患者血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、ALT、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、高敏肌鈣蛋白Ⅰ(CTNI)均升高(p＜0.05)，而HDL-C下降(p＜0.05)。
　　(2)血漿DKK1、PA

14、I1、TF、IL-17和IL-1β濃度的組間比較
　　與正常對照組相比，UA組和AMI組血漿DKK1、PAI1、TF和IL-17濃度均升高(p＜0.05)，IL-1β表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。與UA組相比，AMI組血漿DKK1、PAI1、TF和IL-17表達(dá)增加(p＜0.05)。
　　(3)血漿DKK1與PAI1、TF、IL-17和IL-1β的相關(guān)性分析Pearson直線相關(guān)分析顯示血漿DKK1與PAI1、TF和IL

15、-17均呈正相關(guān)(p＜0.01)。
　　(4)血漿DKK1用于UA診斷和UA與AMI鑒別診斷特異性、敏感性和臨界值的初步分析
　　ROC曲線初步分析血漿DKK1濃度檢測用于UA診斷的價(jià)值，ROC曲線下面積為0.956，敏感度為0.963，特異度為0.867，臨界值為460.60pg/ml。
　　ROC曲線初步分析血漿DKK1濃度檢測用于UA和AMI鑒別診斷的價(jià)值，ROC曲線下面積為0.869，敏感度為0.947，特異度