昆蟲桿狀病毒經(jīng)口感染因子間的相互作用及P74與宿主中腸互作蛋白的研究.pdf

1、昆蟲桿狀病毒在生活周期中會產(chǎn)生兩種表型不同但遺傳物質(zhì)相同的病毒，即出芽型病毒(Budded virus，BV)和包涵體衍生型病毒(Occlusion-derived virus,ODV)。ODV包裹在包涵體中，被幼蟲食下后通過感染中腸上皮細胞感染宿主幼蟲，這個過程稱為經(jīng)口感染。多種ODV囊膜蛋白在經(jīng)口感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們被稱為經(jīng)口感染因子(PIFs)。之前研究表明有9種ODV蛋白，包括7種PIFs:P74、PIF1、PIF2、PIF

2、3、PIF4、PIF6、P95(Ac83)和2種ODV特異性蛋白，Ac5和Ac108，可能與ODV表面復(fù)合物相關(guān)，該復(fù)合物被稱為PIF復(fù)合物。本研究以桿狀病毒模式種-苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)為研究對象，利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補技術(shù)探究了與PIF復(fù)合物相關(guān)的9種蛋白之間相互作用的特點。進一步通過截短和敲除分析了

3、P95和PIF1相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。此外，作為最早被鑒定到的經(jīng)口感染因子，P74被發(fā)現(xiàn)與原發(fā)感染中ODV結(jié)合中腸上皮細胞相關(guān)。為了鑒定宿主中腸細胞中與P74互作的蛋白，構(gòu)建了家蠶中腸酵母文庫，并以P74作為誘餌進行酵母雙雜交文庫篩選。主要結(jié)論如下:
　　1.PIF復(fù)合物相關(guān)的9種蛋白相互作用的特點。
　　利用酵母雙雜交系統(tǒng)共鑒定到6個相互作用，分別為PIF1-PIF2、PIF1-PIF3、PIF1-PIF4、PIF1-P9

4、5、PIF2-PIF3和PIF3-PIF4，其中PIF1-PIF3、PIF2-PIF3、PIF1-P95為強相互作用，其他的為中等強度相互作用。P74、PIF6、Ac5和Ac108沒有鑒定到參與相互作用。
　　和Y2H結(jié)果一致，BiFC分析結(jié)果表明復(fù)合物中相互作用包括PIF1-PIF2、PIF1-PIF3、PIF1-PIF4、PIF1-P95、PIF2-PIF3和PIF3-PIF4，而其他組合沒有檢測到相互作用。根據(jù)這些結(jié)果推測P

5、IF1是PIF復(fù)合物的中心，其他成分都和PIF1存在相互作用。
　　2.P95和PIF1相互作用的深入分析
　　分別對PIF1和P95進行N端和C端分段截短，然后進行Y2H分析。結(jié)果顯示截掉P95的第200-300個氨基酸(aa)會破壞PIF1和P95之間相互作用，敲除結(jié)果證明P95幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(224-282aa)為PIF1和P95相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。用相同方法證明PIF1的100-200aa也是PIF1和P95相互

6、作用的關(guān)鍵序列。
　　3.P74與家蠶中腸互作蛋白的鑒定
　　提取5齡第3天家蠶幼蟲中腸RNA，構(gòu)建了家蠶中腸酵母文庫。以P74作為誘餌對文庫進行篩選，共篩選到6種候選蛋白，分別為U3small nucleolar ribonucleoprotein protein IMP3、60S ribosomal protein L5、JAB-MPN domain protein、Actin,cytoplasmic A3、35kDa

7、proteasecysteine、histidine-rich protein1-B和eukaryotic translation initiation factor1A，最后鑒定到3種可能的互作蛋白，分別為JAB-MPN domain protein、Actin，cytoplasmic A3、35kDa protease。免疫共沉淀結(jié)果進一步表明JAB-MPN domain protein和P74之間存在強烈互作，這個蛋白可能是ODV