基于干細(xì)胞模型的落葉松遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及優(yōu)化.pdf

1、落葉松（Larix Mill）是我國(guó)北方重要的速生用材造林樹種，開(kāi)展落葉松分子育種研究、加速其遺傳改良進(jìn)程是現(xiàn)代高效人工林培育的一個(gè)重要任務(wù)。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生相似于合子胚發(fā)育，是植物人工胚胎研究與應(yīng)用的重要途徑，是林木品種改良、無(wú)性繁殖與基礎(chǔ)研究的理想實(shí)驗(yàn)體系，也是基因工程的橋梁。建立并優(yōu)化基于干細(xì)胞模型的落葉松轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，將外源基因高效導(dǎo)入落葉松基因組，進(jìn)行重要目標(biāo)性狀基因功能驗(yàn)證及表達(dá)調(diào)控研究、加速落葉松生物育種進(jìn)程具有重要的

2、科學(xué)意義及應(yīng)用價(jià)值。
　　本文以落葉松為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)39個(gè)細(xì)胞系原胚發(fā)育與體細(xì)胞胚成熟情況，篩選出細(xì)胞系638、119、113等三個(gè)細(xì)胞系作為轉(zhuǎn)化細(xì)胞系；并進(jìn)行其抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化體系研究，主要研究結(jié)果如下：
　　1.通過(guò)對(duì)39個(gè)落葉松細(xì)胞系的原胚組織與體細(xì)胞胚成熟及發(fā)育狀況篩選研究，表明日本落葉松（Larix leptolepis）638、113兩個(gè)細(xì)胞系與長(zhǎng)白落葉松（L. olgensis）

3、109細(xì)胞系的再生能力強(qiáng)，三個(gè)細(xì)胞系可以用于遺傳轉(zhuǎn)化研究，可作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體材料。
　　2．通過(guò)對(duì)篩選性抗生素—卡那霉素（Kan）、潮霉素（Hyg）以及抑菌性抗生素—頭孢霉素（Cef）及羧芐青霉素（Cb）研究表明：(1) Kan對(duì)細(xì)胞系638、109、113的敏感性臨界濃度分別為25mg/L、20mg/L、15mg/L；Hyg分別為5mg/L、3mg/L、3mg/L；在臨界濃度時(shí)，Hyg比Kan作用快；(2) Cef抑制農(nóng)桿菌

4、生長(zhǎng)的合適濃度為300mg/L；在300-500mg/L濃度范圍內(nèi)，Cef促進(jìn)該細(xì)胞系的生長(zhǎng)，而Cb則具有抑制作用。
　　3．通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的落葉松細(xì)胞系遺傳轉(zhuǎn)化中受體材料基因型、培養(yǎng)方式、菌液浸染濃度和時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等因素影響研究表明：(1)以攜帶質(zhì)粒 pCHF3-gp和pSuper1300+-HC的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化細(xì)胞系638、109、113，獲得54個(gè)抗性細(xì)胞系，經(jīng)分子檢測(cè)進(jìn)一步獲得10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系；(2)以固體培養(yǎng)基上的638

5、為受體，經(jīng)濃度OD600值0.4-0.6攜質(zhì)粒pSuper1300+-HC的農(nóng)桿菌浸染10-20min，共培養(yǎng)2d，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)（0.94個(gè)/g），表明細(xì)胞系638是較為理想的轉(zhuǎn)化受體；(3)Kan篩選獲得的抗性細(xì)胞系較少，且假陽(yáng)性率較高；而Hyg篩選則能獲得較多抗性細(xì)胞系，且假陽(yáng)性率低。表明Kan與Hyg篩選效率差別較大。
　　綜上所述，我們建立并優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的落葉松細(xì)胞系遺傳轉(zhuǎn)化體系，總結(jié)并優(yōu)化了前三部分研究成果，闡述了已