若干分子標志物及臨床特征與惡性黑色素瘤預后的多因素相關分析.pdf

1、研究背景:
　　 惡性黑色素瘤(malignant melanoma MM)是由異常黑素細胞過度增生引發(fā)的常見皮膚腫瘤，其發(fā)病率隨人種、地域、種族的不同而有所差異，白種人的發(fā)病率遠較黑種人高，居住在澳大利亞昆士蘭州的白種人其發(fā)病率高達17/10萬。我國雖屬低發(fā)地區(qū)，但近年來發(fā)病率卻呈倍數(shù)增長，據(jù)統(tǒng)計，2000至今每年新發(fā)病例約2萬人，MM已經(jīng)成為嚴重危害我國人民健康的疾病之一。
　　 MM多為原發(fā)，但長期的色素性皮損惡變

2、為黑色素瘤臨床并不少見，外傷、反復摩擦，激光、冷凍、化學腐蝕劑消痣術導致惡變也時有所見。MM可表現(xiàn)為皮膚結(jié)節(jié)狀或輻射性生長病灶?？蔀樽攸S色、棕色、藍色、桃紅色、黑色，正常皮膚紋理消失，邊緣可呈鋸齒狀，病變可呈局部隆起，繼發(fā)潰瘍，滲出出血，疼痛，晚期可出現(xiàn)衛(wèi)星結(jié)節(jié)。下列幾種情況常提示色素性皮損早期惡變:顏色改變;邊緣參差不齊;病灶隆起;短期快速增大;表面不光滑、脫屑、滲液、出血;局部疼痛。
　　 近幾十年全球MM的發(fā)病率持續(xù)增加。

3、其在男性惡性疾病中增長最快，在女性中僅次于肺癌，年增長率為3-5％。MM在男性和女性惡性疾病中分別占第5位和第6位，根據(jù)死亡風險來說僅次于成人白血病。中位發(fā)病年齡為45-55歲。發(fā)生MM的高危因素包括明確的家族史，黑色素瘤病史，多發(fā)非典型痣或發(fā)育不良痣和先天基因突變。除外內(nèi)因，陽光暴曬也可能對黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展起推動作用。皮膚容易被曬傷且皮膚白皙的個體的患病風險更高。然而黑色素瘤也發(fā)生于任何人種和未接受過大量陽光暴曬的人群。MM在我國發(fā)

4、病率較低，但近年來成倍增長。2000年發(fā)病率統(tǒng)計僅為0.2/10萬，2005-2007年約為1/10萬，每年新發(fā)病例約2萬人。因此MM已經(jīng)成為嚴重危害我國人民健康的疾病之一。我國黑色素瘤發(fā)病率增高主要有以下幾個原因:
　　 (1)濫用雌激素類藥物;
　　 (2)免陷缺陷;
　　 (3)大氣污染;
　　 (4)化學性皮膚污染;
　　 (5)知識缺乏，對該病不夠重視。
　　 進展期的MM死亡率

5、較高，腫瘤厚度＜0.75mm的患者正確治療后長期存活率可達90-95％，一旦厚度超過4mm，5年生存率有30％左右。目前對進展期MM的進行有效治療仍相當困難。我國雖為MM的低發(fā)地區(qū)，但大多數(shù)患者確診時已為時較晚，因此如何對MM進行正確的早期診斷與制定個體化的綜合治療方案是急需解決的問題。澳大利亞國家健康與醫(yī)學研究理事會(Australian Government National Health andMedical Research C

6、ouncil NHMRC)針對MM的診斷更是提出“早期診斷即為挽救生命”的口號。
　　 臨床上腫瘤呈黑色或黃褐色，亦可呈淡紅色，息肉狀，基底常較廣，大小不等。MM可表現(xiàn)出多種不同的大體及組織學形態(tài)。原發(fā)性MM常見的組織學類型包括淺表擴散型，結(jié)節(jié)型，惡性雀斑樣，肢端雀斑樣;少見類型有上皮樣，促纖維增生性，惡性無色素痣等。因為上述所有類型可能并無色素，所以這類病例診斷比較困難，免疫組化和細胞遺傳學的分析對于MM正確診斷相當重要。在M

7、M診斷中，病理學檢查是其確診甚至分期的最終標準。免疫組化是指導性的檢測手段，同時也可用于預后的評判。S-100、HMB45和波型蛋白(Vimentin)是診斷MM的較特異指標。S-100蛋白是診斷MM的良好標記物，敏感性強，但特異性差，故常與其他標記物合用，如HMB45，94.7％的MM均表達S-100蛋白，其存在于各種類型的黑色素痣和黑色素瘤內(nèi)。HMB45敏感性不及S100，但其在MM診斷中更具特異性。Vimentin在惡性黑色素瘤中

8、有較高的表達率，有報道Vimentin在皮膚MM的陽性表達率可達100％，但Vimentin對MM缺乏特異性，大多數(shù)肉瘤及一些低分化癌也可表達，因此Vimentin要與其他抗體如HMIM5、S-100蛋白結(jié)合使用。近年隨著分子生物學特征、臨床組織學特征和基因突變之間的關系研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)特定類型與特定基因變異相關，新的分類法更有利于臨床應用，目前國際上傾向于將黑色素瘤分為四類:肢端型、黏膜型、慢性日光損傷型、非慢性日光損傷型。全世界M

9、M病例的數(shù)量增幅遠遠快于其他惡性腫瘤。其有著快速的轉(zhuǎn)移性、對治療的抵抗性和較高的死亡率等特征，其預后與多項臨床因素、分子生物學指標及基因表達相關。目前普遍認為與其預后相關的因素包括有年齡、腫瘤厚度、原發(fā)病灶是否潰瘍、病灶切緣情況、Clark分級、AJCC臨床分期、有絲分裂率(Mitotic rate MR)、前哨淋巴結(jié)(sentinel lymph node SLN)是否轉(zhuǎn)移、LDH值。近年許多研究都在探究對MM形態(tài)學以外的有預后意義的

10、輔助指標，包括有突變型p53蛋白、Ki-67、增殖細胞核抗原、Ki-S5、熱休克蛋白、bcl-2蛋白，cyclinD1、cyclinD3等。已證實有大量的蛋白分子，癌基因、抑癌基因或其他基因參與MM的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移，但其機制還遠未徹底闡明。2011版的中國黑色素瘤診斷指南新增了KIT基因和BRAF基因突變?yōu)槠つwMM獨立預后不良因素，KIT基因突變?yōu)檎衬M的獨立預后不良因素。但由于基因檢測技術有一定臨床限制性，目前諸多研究致力于用

11、蛋白質(zhì)組學的方法檢測與MM腫瘤生長、轉(zhuǎn)移有關的分子標志物。
　　 S100蛋白是一組低分子量的鈣結(jié)合蛋白，其21KD部分在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細胞中首次被檢測出來，1981年，Gaynor等發(fā)現(xiàn)在人黑色素瘤細胞中也存在S-100蛋白，使其成為一個廣泛運用的診斷性指標。S100有兩種亞單位α和β產(chǎn)生三種二聚體。不同的S100蛋白含有類似的氨基酸結(jié)構域，在氨基端和羧基端均含有疏水區(qū)，在每個亞基的羧基端均含有1個EF手型鈣離子結(jié)合區(qū)，當

12、與鈣離子結(jié)合后，S100蛋白構象發(fā)生改變，暴露出其與靶蛋白的結(jié)合位點，進而通過與相應的靶蛋白作用發(fā)揮其生物學效應。S-100蛋白敏感性高，但缺乏特異性，除黑素細胞以外，Schwann細胞、肌上皮細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、組織細胞以及郎格漢斯細胞(Langerhans cell)均呈陽性。因此其用于MM診斷需結(jié)合其他特異性較高的指標，如HMB46。已有相關文獻報道在Ⅱb/Ⅲ期患者中S100B的高表達與其不良預后明顯相關，S-100B可以作

13、為一個預后指標用來預測Ⅲ期患者的治療效果;還有相關研究表明S100A13可能是MM的血管源性分子標記物。
　　 Vimentin又名波形蛋白，其C端尾部特異結(jié)合細胞核外膜，N端頭部結(jié)合細胞膜，故在細胞核和細胞膜之間形成聯(lián)接。維持細胞結(jié)構和形態(tài)的細胞骨架由一系列復雜的結(jié)構蛋白組成，包括微管、微絲和中間絲（intermediate filament，IF）。Vimentin是存在于間充質(zhì)細胞中的一種中間絲蛋白，屬于Ⅲ型IF，表達在間

14、充質(zhì)細胞和一些外胚層細胞，如成纖維細胞和內(nèi)皮細胞高豐度表達，常在分化特異性的中間絲蛋白，如肌間線蛋白和神經(jīng)絲蛋白表達和整合前形成支撐網(wǎng)絡。因Vimentin有蛋白激酶C和蛋白激酶A磷酸化位點，通過磷酸化與去磷酸化，細胞可改變不溶解的中間絲網(wǎng)絡，且Vimentin有調(diào)節(jié)細胞骨架蛋白、細胞粘附分子等蛋白間的相互作用，同時參與腫瘤細胞和腫瘤相關內(nèi)皮細胞、巨噬細胞的粘附、遷移、侵襲和細胞信號轉(zhuǎn)導。故其高度動態(tài)的聚合解聚間的平衡和其復雜的磷酸化形

15、式可能是Vimentin參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程及細胞-細胞間相互作用的調(diào)節(jié)機制。近些年研究顯示Vimentin與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關，且在間質(zhì)來源腫瘤細胞顯示陽性，在上皮來源腫瘤顯示陰性，故此表明，Vimentin陽性提示腫瘤惡性發(fā)生的上皮間質(zhì)化，且在侵襲性腫瘤細胞系中的表達顯著升高，且其表達與腫瘤惡性程度及預后呈現(xiàn)正相關。已有國外研究報道Vimentin蛋白表達水平與MM血行轉(zhuǎn)移相關，可影響患者的預后。
　　 HMB45是一種抗惡

16、性黑素瘤的單克隆抗體，能識別前黑素小體球蛋白，可與不成熟的黑素細胞及黑素瘤細胞起反應，在惡性黑素瘤的診斷中具有較高特異性。但其敏感性較低，即對表皮的惡性黑素瘤細胞呈強陽性，對真皮、軟組織及淋巴結(jié)內(nèi)惡性黑素瘤細胞具有較高的弱陽性或陰性率。尤其是梭形細胞黑素瘤及促纖維生成性黑素瘤幾乎不表達。無色素型惡性黑色素瘤組織中HMB45陽性表達率高，免疫標記有助于無色素性病例的確診和鑒別診斷。其與MM預后是否相關尚未見報道。
　　 至目前為止

17、，有關能影響MM患者預后的形態(tài)學因子及分子生物學指標的研究結(jié)果尚未達成明確共識。
　　 目的:
　　 經(jīng)過幾十年的研究，MM患者的預后有了很大程度上的進步，但總體而言其預后仍然較差，特別是進展期及術后復發(fā)的患者，其中位生存期不到1年。因而探討與MM預后相關的因素就顯得尤為重要。之前的研究普遍認為與MM預后有關的因素僅僅限于各項形態(tài)學指標。近年來分子生物學指標與腫瘤預后的關系日益受到人們的重視，已有研究揭示了S-100、V

18、imentin等蛋白表達與腫瘤轉(zhuǎn)移及預后的關系。但也有文獻報道其對MM患者的預后估計作用不大，其是否能影響疾病的分期，從而指導有效的個體化治療方案的制定還有待研究探討。本實驗研究對南方醫(yī)院2001年1月～2011年12月手術切除的MM標本127例進行隨訪，并收集相關臨床及病理資料。采用免疫組化SP法檢測病灶組織中S-100、Vimentin及HMB45蛋白表達水平。探討各種臨床因素及分子生物學指標與MM預后的關系。
　　 方法:

19、
　　 第一章收集病例資料并隨訪，分析相關臨床病理因素與MM預后的關系
　　 1.收集資料收集我院2001年1月～2011年12月手術切除的MM標本127例，并經(jīng)病理學證實為MM。并對其進行預后隨訪，生存期的計算從患者接受手術之日起至死亡或2011年11月末次隨訪日止，至末次隨訪日仍存活者生存時間定為刪失值。
　　 2.整理臨床資料及數(shù)據(jù)127例患者的臨床資料按年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、是否潰瘍、手術切緣情況、C

20、lark分級、AJCC臨床分期、初診淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移數(shù)目、治療方法及療效分組。
　　 3.統(tǒng)計學分析使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用壽命表法計算生存率，應用Kaplan-Meier法繪制累計生存率曲線，Log-rank檢驗進行生存曲線之間的比較，Cox比例風險回歸模型進行單因素和多因素回歸分析，P＜0.05認為具有統(tǒng)計學意義。
　　 第二章免疫組化法檢測S-100、Vimentin及HMB45蛋白表達水

21、平，分析其與MM預后的相關性
　　 1.免疫組化方法:本實驗采用免疫組織化學SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法）
　　 2.統(tǒng)計學方法使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用壽命表法計算生存率，應用Kaplan-Meier法繪制累計生存率曲線，Log-rank檢驗進行生存曲線之間的比較，Cox比例風險回歸模型進行單因素和多因素回歸分析，P＜0.05認為具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 第一

22、章收集病例資料并隨訪，統(tǒng)計學分析相關臨床因素與MM預后的關系
　　 1.生存情況全組病例均獲得完整隨訪，隨訪時間為1～138個月，中位隨訪時間36.00個月，隨訪期間死亡72例(56.7％)。127例MM患者中位存活時間為36.00個月，1年、3年和5年生存率分別為79％、50％和40％。
　　 2.單因素COX回歸分析結(jié)果本研究中，影響MM預后以死亡為標準。單因素分析結(jié)果顯示，臨床因素包括年齡、是否潰瘍、Clark分級

23、、術后切緣情況、AJCC臨床分期、治療方法及療效與預后相關(P＜0.05)，而性別、腫瘤發(fā)生部位、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移數(shù)目與預后不相關（P＞0.05）。
　　 3.多因素COX逐步回歸分析結(jié)果多因素逐步分析結(jié)果表明年齡、Clark分級、術后切緣情況及療效是MM的獨立預后影響因素。
　　 第二章免疫組化法檢測S-100、Vimentin及HMB45蛋白表達水平，統(tǒng)計學分析其與MM預后的相關性
　　 1.免疫組化SP

24、法檢測HMB45、S-100以及Vimentin在MM病灶組織中的表達。127例MM組織標本中，13例HMB45蛋白表達為陰性（-），82例為弱陽性(+)，22例為中等陽性(++)，10例為強陽性（+++）;10例S-100蛋白表達為陰性(-)，57例為弱陽性(+)，35例為中等陽性(++)，25例為強陽性（+++）;28例Vimentin蛋白表達為陰性(-)，80例為弱陽性(+)，11例為中等陽性(++)，8例為強陽性（+++）;HM

25、B45、S-100以及Vimentin在127例MM中的陽性表達率分別為89.8％、92.1％和78.0％。
　　 2.本研究中，影響MM預后以死亡為標準。單因素分析結(jié)果顯示，S-100蛋白表達水平與預后相關(P＜0.05)，而HMB45和Vimentin蛋白表達水平與預后不相關(P＞0.05)。
　　 3.多因素逐步分析結(jié)果表明，S-100蛋白表達水平是MM的獨立預后影響因素。
　　 結(jié)論:
　　 1.

26、本研究127例MM患者中位存活時間為36.00個月，1年、3年和5年生存率分別為79％、50％和40％，表明MM患者的預后仍然較差。
　　 2.臨床因素與預后關系的研究:本研究中影響MM預后的因素包括年齡、是否潰瘍、Clark分級、術后切緣情況、AJCC臨床分期、治療方法及療效，其中n年齡、Clark分級、病灶切緣情況與療效是獨立預后影響因子;而性別、腫瘤發(fā)生部位、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移數(shù)目與預后不相關。
　　 3.分子生

27、物學標記物與預后關系的研究:HMB45、S-100以及Vimentin在127例MM中的陽性表達率分別為89.8％、92.1％和78.0％。表明其對MM早期診斷有重要意義。統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示，S-100蛋白表達水平與預后相關，且為獨立預后影響因子。而HMB45和Vimentin蛋白表達水平與預后不相關。
　　 4.關于MM的分期標準:在過去，評估MM分期的指標僅僅限于組織學指標（腫瘤厚度及潰瘍，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）。隨著分子生物學技術

28、及基因技術的發(fā)展，諸多蛋白標記物及基因指標皆被用來更全面更準確地對腫瘤進行分期。目前，AJCC分期中唯一用到的血清學指標是LDH水平。已有諸多研究表明S-100蛋白的表達水平較LDH對MM預后的評估更有特異性和靈敏度。本研究證實了S-100蛋白水平與預后的相關性。
　　 5.關于MM的治療MM是一種高度惡性，易轉(zhuǎn)移，預后差，對化療放療均不敏感的惡性腫瘤，隨著腫瘤免疫學，分子生物學技術的迅速發(fā)展，過繼免疫治療、生物化學治療、腫瘤疫

29、苗、靶向等治療MM的方法顯示了良好的應用前景。針對MM患者目前多主張采取多學科綜合治療模式。免疫治療成為主要的輔助治療手段。NCCN指南推薦1年高劑量α-2b干擾素輔助治療主要適應人群為Ⅱb期以上（含Ⅱb期）的高危術后患者。Ⅳ期或者不能手術切除的患者治療在近兩年獲得突破性進展，NCCN在2011年引入了Ipillimumab(抗CTLA-4單抗)列為標準治療。針對免疫治療明顯的毒副作用，可以檢測相關分子標記物水平，結(jié)合臨床因素選擇合適的