冬凌草甲素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PATU8988生物學(xué)特性影響及機(jī)制的研究.pdf

1、胰腺癌發(fā)病隱匿，進(jìn)展迅速，預(yù)后極差，病死率高。手術(shù)是主要治療手段，但因早期診斷困難，大部分患者確診時(shí)已無(wú)手術(shù)機(jī)會(huì)。多數(shù)病人表面上腫瘤局限，實(shí)際上微小轉(zhuǎn)移灶已經(jīng)存在。手術(shù)仍是治愈該病的主要手段。隨著新型化療藥物和方案的不斷涌現(xiàn)，放療技術(shù)及設(shè)備的明顯改進(jìn)和以基因治療和免疫治療為代表的生物療法的發(fā)展，胰腺癌的治療手段更加多樣化和正規(guī)化。但是胰腺癌細(xì)胞對(duì)多數(shù)化療藥物不敏感，目前尚無(wú)滿意的治療方法。冬凌草甲素是從冬凌草等植物葉子中提取出的一種貝殼

2、杉烯二萜類化合物，具有好的抗腫瘤活性，目前是臨床應(yīng)用中最重要的中草藥之一。半個(gè)世紀(jì)以前，人們就發(fā)現(xiàn)了冬凌草甲素除了抗炎作用，還具有免疫調(diào)節(jié)和抗病毒的作用，最近研究治療表明，冬凌草甲素是非常有效的抗癌藥物，對(duì)一些惡性腫瘤如前列腺癌，乳癌，非小細(xì)胞肺癌等有很好的抗癌作用。但是其抗癌機(jī)理沒有被完全闡明。為了揭示其可能的抗癌機(jī)理，通過研究不同濃度的冬凌草甲素抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和對(duì)凋亡的影響以及侵襲性影響，通過測(cè)定相關(guān)基因的變化，探討冬凌草甲素

3、對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PATU8988的生物學(xué)特性的影響及可能機(jī)制，為臨床治療胰腺癌提供依據(jù)。 一、目的 體外研究冬凌草甲素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ATU8988的生物學(xué)特性影響以及可能的作用機(jī)制。 二、方法 以人胰腺癌細(xì)胞PATU8988為體外模型，用冬凌草甲素處理該細(xì)胞，利用MTT法（四甲基偶氮唑藍(lán)）檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)PATU8988細(xì)胞的增殖抑制作用，光學(xué)顯微鏡觀察冬凌草甲素處理后PATU8988細(xì)胞形態(tài)的改變，A

4、nnexinⅤ（標(biāo)記有異硫氰酸熒光素的連接素Ⅴ）/PI（碘化丙啶）雙染色，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定AnnexinⅤ+/PI-細(xì)胞比例，利用Rh123標(biāo)記經(jīng)冬凌草甲素誘導(dǎo)的PATU8988細(xì)胞，F(xiàn)ACS測(cè)定線粒體膜電位（△Ψm）的改變。利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因P53、Bcl-2、STAT-3、VEGF、MMP-9的表達(dá)變化。 三、結(jié)果 MTT結(jié)果顯示隨著冬凌草甲素藥物濃度的增加（2，4，8，16，32，64，128mg

5、/L）和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，PATU8988細(xì)胞的增殖明顯受到抑制。 光學(xué)顯微鏡觀察，隨著冬凌草甲素藥物濃度的增加出現(xiàn)凋亡細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)特征改變：表現(xiàn)為胞漿空泡，核染色質(zhì)向核一側(cè)固縮呈現(xiàn)半月形，并可見凋亡小體，細(xì)胞體積縮小。在2mg/L作用24h基本無(wú)凋亡，8mg/L作用24h可見部分凋亡，至72h內(nèi)，凋亡現(xiàn)象明顯。128 mg/L作用8h即開始呈現(xiàn)凋亡，作用24h開始出現(xiàn)壞死。 流式細(xì)胞儀分析測(cè)定AnnexinⅤ+/PI

6、-細(xì)胞率，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素（0，8，16，32，64mg/L）作用24小時(shí)后，PATU8988細(xì)胞凋亡比率隨冬凌草甲素誘導(dǎo)濃度升高而增加。 FACS測(cè)定PATU8988細(xì)胞線粒體膜電位，發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位降低（P<0．05）。 冬凌草甲素（4，8，16，32，64mg/L）誘導(dǎo)PATU8988細(xì)胞24h后，半定量分析PATU8988細(xì)胞P53、Bcl-2、STAT-3、VEGF、MMP-9 mRNA表達(dá)水平。未處理的PAT

7、U8988細(xì)胞均有Bcl-2、STAT-3、VEGF、MMP-9的mRNA表達(dá)，加入冬凌草甲素后，Bcl-2、STAT-3、VEGF、MMP-9的表達(dá)隨藥物濃度增加表達(dá)下降，而P53的mRNA表達(dá)水平，隨藥物濃度增加而上升，也呈劑量依賴。 四、結(jié)論 1．冬凌草甲素能抑制PATU8988細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有一定的濃度和時(shí)間依賴性。 2．能誘導(dǎo)PMU8988細(xì)胞凋亡，經(jīng)冬凌草甲素處理后PATU8988細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡細(xì)胞典

8、型的形態(tài)學(xué)特征改變，流式細(xì)胞儀分析測(cè)定AnnexinⅤ陽(yáng)性細(xì)胞率，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素作用24小時(shí)后，PATU8988細(xì)胞凋亡比率隨藥物濃度升高而增加。線粒體膜電位降低也說明細(xì)胞的凋亡。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其主要細(xì)胞毒作用之一。 3．能抑制VEGF、MMP-9的mRNA表達(dá)，從而可能降低PATU8988細(xì)胞的侵襲性。抑制STAT-3的表達(dá)，抑制增殖作用可能與此有關(guān)。 4．在細(xì)胞凋亡過程中抑癌基因P53基因上調(diào)，而抗凋亡基因Bcl-2