DNMT1RNA1重組桿狀病毒載體對胰腺癌細胞PaTu8988的影響.pdf

1、胰腺癌是一種惡性程度極高的消化道惡性腫瘤。近年來,其發(fā)病率在世界各地均有迅速增加,在男性居惡性仲瘤死亡因為的第五位,在女性居惡性腫瘤死亡因為的第四位,5年生存率僅為1％-4％[1-4]。胰腺癌早期一股沒有明顯癥狀,出現臨床癥狀就診時往往已發(fā)生轉移,喪失手術時機,且由于其轉移傾向以及對細胞毒性化療藥物產生耐受性,而導致傳統非手術療法通常無效,預后極差。目前臨床上對晚期胰腺癌缺少有效的治療方法。因此,迫切需要進一步深入探討其發(fā)生、發(fā)展的分子

2、機制,從而尋找更有效的早期診斷與治療措施,改善其預后。
　　 DNA甲基化是重要的基因表觀修飾方式之一[5]。DNA甲基化能關閉某些基因的活性,去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達[6]。DNA的甲基化是在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5端的胞嘧啶轉變?yōu)?’甲基胞嘧啶[7]。這種DNA修飾方式并沒有改變基因序列,但是它調控了基因的表達。近年,研究表明在多種人類

3、腫瘤基因組中,廣泛低甲基化和部分區(qū)域的高甲基化共存是DNA甲基化水平總的特征,5’端CpG島局部高甲基化致抑癌基因失活是引起細胞惡性轉化的重要步驟[8]。
　　 DNMTs家族中主要有DNMT1,DNMT2,DNMT3a,DNMT3b四種酶[9]。DNMT1是在體細胞中最豐富的甲基轉移酶,被認為是主要的具有維持甲基化作用的酶。目前認為甲基轉移酶的表達水平反映了腫瘤中增殖細胞的生理狀態(tài)和各種分化缺陷。研究發(fā)現,甲基轉移酶活性增加是

4、所有轉化細胞的特征之一,甲基轉移酶活性增加能誘導細胞轉化,這可能是CpG島甲基化程度的提高使抑癌基因表達受抑制或影響了細胞周期。
　　 多項研究證明基因異常甲基化在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起作用,其中,DNMTs在基因的異常甲基化中起了非常重要的作用[10]。另外,靶向性的沉默DNMT1可以引起腫瘤細胞的生長抑制、凋亡增加伴有DNA甲基化改變。Peng等研究發(fā)現多個胰腺癌相關基因甲基化與DNMT1蛋白表達相關,同時發(fā)現在胰腺導

5、管上皮內瘤變向進展期胰腺癌的發(fā)展過程中,DNMT1起了非常重要的作用[11]。Rhee等發(fā)現在結腸癌HCT116細胞株中靶向性沉默DNMT1基因,只能引起細胞總體甲基化水平下降20％,并不能有效引起抑癌基因啟動子的去甲基化和抑癌基因的重新表達；進一步研究發(fā)現同時剔除DNMT1和DNMT3b基因,可以引起細胞總體甲基化水平下降95％,引起許多抑癌基因的重新表達,并有效抑制了結腸癌細胞的生長[12]。Oridate等利用siRNA干擾人肺非

6、小細胞癌A549細胞株后,使DNMT1蛋白表達明顯降低,對細胞生存有明顯抑制作用,使生存率下降至原先的75％和65％,且抑制作用明顯高于甲基轉移酶抑制劑(5-aza-dC)；同時抑癌基因p21的表達明顯升高[13]。Suzuki等研究發(fā)現通過沉默DNMT1基因可以使非小細胞肺癌NCI-H1299和乳腺癌HCC1954細胞的RASSF1A,p16ink4A,CDH1和HPP1基因啟動子的甲基化水平降低80％,同時伴有這些抑癌基因重新表達[

7、14]。Robert等研究發(fā)現無論使用反義核苷酸還是siRNA,選擇性敲除DNMT1,均能明顯降低結腸癌王HCT116、SW48和SW480細胞內的DNMT的活性,并引起細胞總體甲基化水平下降和抑癌基因CDKN2A的重新表達。Leu等研究發(fā)現在抑制卵巢癌CP70細胞生長方面,聯合沉默DNMT3b和DNMT1基因對抑制腫瘤細胞的生長作用明顯強于單獨沉默DNMT3b基因；去甲基化作用方面,聯合兩種siRNA干擾引起癌細胞去甲基化的作用較明顯

8、；單獨沉默DNMT3b或DNMT1基因,可以引起TWIST、RASSF1A和HIN-1 mRNA表達升高1-3倍,同時沉默DNMT1和DNMT3b可引起TWIST、HIN-1mRNAs升高7倍,RASSF1A mRNAs升高15倍。認為維持細胞內甲基化的關鍵酶是DNMT1,DNMT3b只是起輔助DNMT1的作用[15]。Ting等研究發(fā)現沉默DNMT1基因后,結腸癌SW48細胞、膀胱癌T24細胞內甲基轉移酶的活性明顯下降,但細胞內仍維持

9、了DNA高甲基化水平。但乳腺癌T47D用瞬時轉染干擾DNMT1 mRNA后,DNMT1蛋白表達明顯下降,甲基轉移酶的活性降低90％,同時細胞的Cdkn2a、Sfrp1和Gata4基因的啟動子發(fā)生去甲基化,基因的mRNA明顯升高。提示對于維持細胞內甲基化水平,不同的人腫瘤細胞對DNMT1的依賴程度是不同的[16]。Sowińska等構建了穩(wěn)定表達沉默DNMT1和(或)DNMT3b基因的乳腺癌MCF-7細胞和胰腺癌AsPC1細胞的細胞株,分

10、別干預DNMT1和DNMT3b可引起甲基化水平下降59％、57％、45％和38％,聯合干擾兩個基因可引起CXCL12啟動子CpG島甲基化水平下降75％和68％,同時發(fā)現甲基轉移酶抑制劑5-dAzaC可引起CXCL-12啟動子CpG島甲基化水平下降93％和94％[17]。總的來說,DNMTs在多種腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展中起了重要的作用,DNMT1和DNMT3b在不同腫瘤疾病中所起的作用不盡相同。目前,DNMTs在胰腺癌中的起所起的作用,以及

11、沉默DNMT1基因對胰腺癌的治療作用如何的研究甚少。
　　 本研究主要通過構建攜帶DNMT1 RNAi基因的重組桿狀病毒載體,并以此進一步研究DNMT1對胰腺癌細胞及相關基因的影響。通過構建攜帶DNMT1 RNAi基因的重組桿狀病毒載體,沉默DNMT1基因觀察其對胰腺癌細胞周期及胰腺癌相關基因的影響。本研究分二部分:
　　 1、構建攜帶DNMT1 RNAi基因的重組桿狀病毒載體。結果表明重組桿狀病毒能夠感染PaTu898