瘦素在缺氧預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細胞保護心肌中的重要作用.pdf

1、背景:在全球范圍內(nèi)，心血管疾病在人群中的發(fā)病率以及造成的死亡率都處于領(lǐng)先地位，而冠心病心肌梗死是心血管死亡的主要原因。大量的研究證明細胞移植療法能改善心肌梗死后心功能，近幾年已經(jīng)成為了心血管領(lǐng)域研究的熱點。骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有多分化方向能力的成體干細胞，因其能夠在體外大量擴增，進行自體移植無排異及來源的限制，也不涉及倫理問題，在細胞移植治療中具有獨到之處。大量研究顯示，間充質(zhì)干

2、細胞經(jīng)0.5％氧濃度缺氧預(yù)處理24h后，其移植治療心肌梗死的效果大大提高。然而目前仍然不清楚為何缺氧預(yù)處理能提高間充質(zhì)干細胞的保護作用。故此，我們在此探討了是何種機制引起了該種效應(yīng)。
　　方法:我們利用全骨髓貼壁的方法分離骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)，按照常氧與缺氧進行預(yù)處理并比較兩者之間的差別(常氧:[21％ O2，5％ CO2]，缺氧:[0.5％O2，5％ CO2])。我們利用實時熒光定量PCR(RT-PCR)、雙抗體夾心酶聯(lián)

3、免疫吸附法(ELISA)檢測MSCs基因及蛋白水平瘦素(leptin)表達。在體外，我們利用共培養(yǎng)的方法觀察骨髓間充質(zhì)干細胞對心肌細胞的保護作用并利用TUNEL染色法檢測心肌細胞凋亡率。在體內(nèi)，我們同樣利用TUNEL染色法檢測移植細胞3天后梗死區(qū)與梗死周邊區(qū)心肌凋亡率。移植細胞28天后我們利用小動物心超及血流動力學(xué)檢測法檢測小鼠心功能并利用Masson's染色法檢測梗死面積。
　　結(jié)果:目前的研究表明，間充質(zhì)干細胞能通過旁分泌的作

4、用分泌多種細胞因子起到保護心肌的作用，leptin是其中重要的一員。大量研究證明leptin能直接抑制心肌細胞凋亡并且能促進血管新生增強缺血心肌血供。
　　1.前期研究中我們通過基因芯片篩查發(fā)現(xiàn)，相較于正常培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞，在缺氧預(yù)處理間充質(zhì)干細胞中，leptin基因表達上調(diào)。于是我們通過熒光實時定量PCR、ELISA檢測，證明缺氧間充質(zhì)干細胞leptin表達顯著提高。
　　2.在體外共培養(yǎng)試驗中我們利用細胞共培養(yǎng)模型，將

5、缺氧預(yù)處理間充質(zhì)干細胞與心肌細胞在缺氧缺血清環(huán)境中共培養(yǎng)來觀察干細胞對于心肌細胞的保護作用。首先我們應(yīng)用基因敲除技術(shù)干擾人間充質(zhì)干細胞中l(wèi)eptin基因表達，發(fā)現(xiàn)當(dāng)leptin基因敲除后其保護心肌細胞的作用大大降低。然后我們又利用leptin缺乏小鼠(ob/ob)間充質(zhì)干細胞，發(fā)現(xiàn)較正常小鼠(C57BL/6)干細胞，其保護心肌細胞的作用同樣大大降低。
　　3.我們利用結(jié)扎小鼠冠狀動脈左前降支的方法制作小鼠心肌梗死模型，移植ob/o

6、b小鼠間充質(zhì)干細胞與正常C57BL/6小鼠干細胞進行對比。細胞移植后3天取小鼠心臟切片，利用TUNEL染色檢查心肌凋亡情況，我們發(fā)現(xiàn)相較于正常缺氧預(yù)處理C57BL/6小鼠移植組，缺氧預(yù)處理ob/ob干細胞移植組小鼠心肌凋亡率明顯提高。移植后28天經(jīng)小動物心超與血流動力學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，缺氧預(yù)處理ob/ob干細胞移植并不能起到保護小鼠心功能的作用。同樣的，masson's染色也表明leptin缺失后缺氧預(yù)處理間充質(zhì)干細胞保護梗死心肌減少心梗面積