PCA3基因啟動子多態(tài)性的DHPLC快速分型方法學建立及其初步臨床應用.pdf

1、目的：
　　 建立應用變性高效液相(DHPLC)技術分析前列腺癌(PCa)特異性PCA3基因啟動子多態(tài)性的技術方法及其初步臨床應用。
　　 方法：
　　 1.根據(jù)Genbank中的PCA3的全序列(AF279290),在其啟動子區(qū)域設計一對引物,以本室先前已經建立的11種(C2T6、C2T5、C3T5、C2T5/C2T6、C3T5/C2T4、G3T5/C4T5、C3T5/C2T5、C3T5/C2T6、G2T5/C

2、1T8、C2T6/C3T4、C2T6/CT7)已知多態(tài)性的PCA3基因啟動子的克隆質粒為標準品,通過優(yōu)化DHPLC檢測體系,建立其多態(tài)性克隆質粒的標準圖譜。
　　 2.對本方法進行方法學評價,包括該方法的準確性和重復性。
　　 3.采用完全隨機設計的方法從189例病理確診為PCa患者的外周血標本選取147例標本,對其PCA3基因啟動子的擴增產物進行DHPLC分析,比較各標本洗脫峰與標準克隆質粒的DHPLC圖譜,以判斷臨床

3、標本PCA3基因多態(tài)性類型,并對這些基因型再行克隆測序予以驗證。
　　 4.應用建立方法學檢測外周血標本[前列腺增生組(BPH)153例和PCa組189例],并統(tǒng)計分析臨床標本中PCA3基因啟動子不同多態(tài)性類型在PCa組、BPH組中的分布。
　　 結果：
　　 1.通過11種已知克隆質粒優(yōu)化DHPLC檢測體系,最適檢測體系為:含44.3％A洗脫液(0.1 mol/L TEAA、0.025％ACN)和55.7％B洗

4、脫液(0.1 mol/L TEAA、25％ACN)的起始洗脫梯度,含35.3％A洗脫液和64.7％B洗脫液的終止洗脫梯度,柱溫53℃,流速:0.9 ml/min,在該條件下DHPLC有較高的重復性,其中4種雙峰型的克隆質粒(C3T5/C2T5、C3T5/C3T4、C2T5/C2T6、C3T5/C4T5)2峰出峰時間之差批間CV值分別為3.85％、0％、3.03％、1.18％,4種3峰型的克隆質粒(C3T5/C2T6、C3T5/C1T8、

5、C2T5/C3T4、C2T6/C2T7)中第2峰與第1峰出峰時間之差批間CV值分別為6.67％、1.96％、4.55％、1.67％,第3峰與第1峰出峰時間之差批間CV值分別為4.55％、0％、1.59％、4.05％,批間CV值在0％～6.67％之間。
　　 2.11種克隆質粒多態(tài)性標本僅通過1～2次洗脫,就能根據(jù)峰型和各峰的出峰時間將其區(qū)分開。147例PCa中,144例DHPLC檢測結果和克隆測序結果一致(Kappa=1,P=0

6、.00),并出現(xiàn)3種新的峰型,經克隆測序驗證為3種新的多態(tài)性(C3T5/C1T6、C2T5/C1T8、C3T5/C2T7)。
　　 3.342例外周血標本DHPLC檢測試驗中,我們檢出了C3T5,C3T5/C3T4,C3T5/C4T5,C3T5/C2T5,C3T5/C2T6,C3T5/C1T8,C2T5,C2T5/C2T6,C2T5/C3T4,C2T6,C2T6/C2T7,C3T5/C2T4,C2T5/C2T7,C3T5/C2T

7、7,C3T4/C2T7,C2T5/C1T8共16種PCA3啟動子多態(tài)性,其中,C2T5/C2T7、C3T4/C2T7、C3T5/C2T4為DHPLC洗脫峰與標準圖譜不一致,經克隆測序證實3種新的多態(tài)性,3種新的多態(tài)性建立新的DHPLC圖譜。含有C3T5型多態(tài)性組中,隨著TAAA重復次數(shù)增加,前列腺癌患病率增加。
　　 結論：
　　 1.成功應用DHPLC技術建立起分析PCA3基因啟動子多態(tài)性的方法學,可對PCA3基因啟動