DIDS對離體心肌細胞缺血再灌注損傷誘導的凋亡及信號分子PI3K-Akt的影響.pdf

1、凋亡(apoptosis)，也稱程序性細胞死亡(programmedcelldeath，PCD)，是細胞受基因調控的主動死亡形式。而缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusioninjury，I/RI）是心血管疾病中一個重要的病理生理過程；研究發(fā)現心肌細胞凋亡是再灌注損傷過程中的一個重要機制。因此，尋找抑制心肌細胞凋亡的發(fā)生、挽救受損心肌細胞新的治療方法，對治療多種心肌細胞凋亡相關性心血管疾病、維護正常心臟功能有重要意義。<

2、br>　　近年來，研究發(fā)現細胞膜內外離子交換的自穩(wěn)態(tài)與凋亡的發(fā)生密切相關。在細胞凋亡過程的早期出現的細胞體積減小即凋亡性容積減?。╝poptoticvolumedecrease，AVD），被認為是一個重要的細胞凋亡的形態(tài)學特征。大量證據提示AVD及激活的離子通道在細胞凋亡過程中起著重要的作用，是細胞凋亡的重要前提；氯離子是機體內最重要，最豐富的陰離子，在多種細胞，通過阻斷該離子通道及細胞體積減小可以抑制細胞凋亡。因此本實驗的目的是在建立

3、I/RI心肌細胞凋亡模型的基礎上，觀察非特異性氯離子通道阻斷劑4,4’-二異硫氰基芪-2,2’-二磺酸（4,4’-Diisothiocyanostilb-ene-2,2’-disulfonicacid，DIDS）對細胞存活及凋亡的影響，并探討了DIDS對細胞內促存活信號分子磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol3’-kinase，PI3K）/Akt及下游分子B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-celllymphoma/l

4、eukemia-2，Bcl-2）/Bax的影響。
　　研究目的
　　1.建立原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞的缺血/再灌注損傷心肌細胞凋亡模型。
　　2.觀察非特異性氯離子通道阻斷劑DIDS對缺血/再灌注損傷誘導的心肌細胞凋亡的影響。
　　3.探討氯離子通道阻斷劑DIDS對PI3K/Akt存活信號分子及其下游分子Bcl-2、Bax的影響。
　　研究方法
　　1.以原代培養(yǎng)的SD（Sprague-Dawley）乳鼠

5、心肌細胞作為研究對象，并通過缺血/再灌注損傷建立心肌細胞凋亡模型。設立正常對照組、缺血/再灌注組（I/R）、DIDS處理組（I/R+DIDS）及LY294002處理組（I/R+LY294002+DIDS）。
　　2.四唑鹽（MTT）比色法觀察心肌細胞的存活率；Hoechst33258染色觀察細胞及細胞核形態(tài)變化；底物酶解熒光法檢測caspase-3活性，反映心肌細胞的凋亡程度；DNA凝膠瓊脂糖電泳法測定細胞凋亡。
　　3.免

6、疫印跡方法觀察氯離子通道阻斷劑DIDS對細胞促存活信號分子PI3K/Akt及其下游分子Bcl-2/Bax的影響。
　　4.免疫熒光雙染色觀察DIDS對缺血/再灌注損傷心肌細胞內Bax的分布。
　　研究結果
　　1.DIDS組在細胞存活率（85.6％）、caspase-3活性（180％）與I/R組（52.4％，410％）比較有顯著性差異（n=12，P<0.01DIDS組vs．I/R組），與I/R組比較DIDS能夠顯著抑制

7、DNA“梯”狀條帶的形成，Hoechst-33258染色陽性細胞明顯減少。說明氯離子通道阻斷劑DIDS可以明顯抑制I/RI誘導細胞凋亡。
　　2.LY294002處理組與DIDS組比較，呈現細胞存活率降低（58.4％）、caspase-3的活性升高（460％），有明顯的凋亡性特征：細胞核碎裂、固縮及明顯的DNA“梯”狀條帶。
　　3.免疫印跡顯示，各實驗組中總Akt的表達水平無差異（n=12，P>0.05），但磷酸化Akt(

8、p-Akt)表達水平在DIDS組中較I/R組明顯升高（n=12，P<0.01DIDS組vs．I/R組），LY294002處理組中即使加入了DIDS，p-Akt水平與I/R組比較也無差異（n=12，P>0.05LY294002處理組vs．I/R組）；但是LY294002處理組中p-Akt水平較DIDS組明顯降低（n=12，P<0.01LY294002處理組vs．DIDS組）。
　　4.免疫印跡顯示，在各實驗組中Bcl-2，Bax表達

9、無明顯差異（n=12，P>0.05）。激光共聚焦顯微鏡顯示，正常細胞中Bax主要分布在細胞質，I/RI誘導心肌細胞凋亡過程中伴有明顯的Bax蛋白向線粒體轉位；DIDS可以抑制I/RI誘導的Bax向線粒體轉位，而LY294002處理后，細胞重新呈現Bax向線粒體轉位。
　　結論
　　1.DIDS能夠明顯抑制I/RI誘導的心肌細胞凋亡，提高細胞存活率。
　　2.DIDS通過激活PI3K/Akt信號分子，增加p-Akt水平達