血小板因子4及其17-70肽段在多發(fā)性骨髓瘤中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究血小板因子4及其17-70肽段在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病過(guò)程中的作用。
　　 方法：將含有PF4全長(zhǎng)cDNA及17-70cDNA基因的質(zhì)粒擴(kuò)增，獲得PF4全長(zhǎng)cDNA及17-70cDNA基因序列，連接入穿梭質(zhì)粒并行基因測(cè)序。用慢病毒包裝系統(tǒng)合成含有PF4全長(zhǎng)cDNA及17-70cDNA和空載體的慢病毒。分別用含有PF4全長(zhǎng)cDNA及17-70cDNA和空載體的慢病毒的轉(zhuǎn)染3種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株，即U266細(xì)胞，RPMI-822

2、6細(xì)胞和LP-1細(xì)胞。篩選出穩(wěn)定表達(dá)外源基因的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株。檢測(cè)篩選出穩(wěn)定表達(dá)外源基因的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株的細(xì)胞及上清液。用密度梯度離心法分離健康成人外周單個(gè)核細(xì)胞。經(jīng)含重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和20％新生牛血清的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)，在第8天收集貼壁細(xì)胞。經(jīng)光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)獲得細(xì)胞。將獲得的各組多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞共同培養(yǎng)，在共同培養(yǎng)48小時(shí)

3、后觀(guān)察人內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖，凋亡和遷移情況。分別用穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染基因蛋白的骨髓瘤細(xì)胞株建立多發(fā)性骨髓瘤聯(lián)合免疫缺陷小鼠動(dòng)物模型。定期檢測(cè)小鼠血清中人輕鏈蛋白的含量及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子含量。并檢測(cè)腫瘤的體積和腫瘤內(nèi)血管密度以及小鼠的生存期。
　　 結(jié)果：穿梭質(zhì)粒載體經(jīng)全長(zhǎng)測(cè)序示：分別含有正確PF4全長(zhǎng)cDNA及17-70cDNA序列。篩選后轉(zhuǎn)染含有PF4全長(zhǎng)cDNA的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞含PF4蛋白陽(yáng)性。3種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株內(nèi)部轉(zhuǎn)染不

4、同基因組間VEGF含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明轉(zhuǎn)染PF4全長(zhǎng)cDNA及17-70cDNA片段2組的MM細(xì)胞均有抑制分泌VEGF作用，轉(zhuǎn)染PF4的17-70cDNA片段組有更強(qiáng)的抑制作用(P＜0.01)。獲得的成人外周血單核細(xì)胞剛接種時(shí)均勻平鋪在培養(yǎng)皿底，加入細(xì)胞因子培養(yǎng)24小時(shí)后開(kāi)始貼壁樣生長(zhǎng)，3天后可見(jiàn)成集落樣生長(zhǎng)，第4天可見(jiàn)細(xì)胞集落增大，貼壁較牢。第8天部分呈梭形改變。2周后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形改變，排列呈線(xiàn)狀。第8天收獲細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)95％以上細(xì)胞

5、攝取1，1'-二(十八烷基)-3，3'，3'，3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸，乙?；兔芏戎鞍?，并結(jié)合FITC標(biāo)記荊豆凝集素。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)獲得細(xì)胞發(fā)現(xiàn)CD133抗原決定簇陽(yáng)性率為0.835±0.053；人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(VEGF-R2)陽(yáng)性率為0.862士0.082；CD34抗原決定簇陽(yáng)性率0.862±0.062。穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染基因的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株與人內(nèi)皮祖細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)后，人內(nèi)皮祖細(xì)胞的凋亡情況各組間無(wú)顯著差異

6、(P＞0.05)。人內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和遷移情況各組間有顯著差異，轉(zhuǎn)染PF4全長(zhǎng)cDNA及17-70cDNA片段2組均有抑制作用，轉(zhuǎn)染PF4的17-70cDNA片段組有更強(qiáng)的抑制作用(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染PF4或17-70cDNA或空載體的3種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞分別植入聯(lián)合免疫缺陷小鼠后，成功建立動(dòng)物模型。注射部位逐漸出現(xiàn)腫塊，經(jīng)病理證實(shí)為漿細(xì)胞腫瘤。3種多發(fā)性骨髓瘤動(dòng)物模型的腫瘤體積和腫瘤組織新生血管密度在轉(zhuǎn)染不同基因組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

7、P＜0.05)。同轉(zhuǎn)染空載體組相比較，轉(zhuǎn)染PF4全長(zhǎng)cDNA組小鼠血清中人輕鏈蛋白含量降低，轉(zhuǎn)染PF4的17-70cDNA片段組降低更加明顯(P＜0.05)。同轉(zhuǎn)染空載體組相比較，轉(zhuǎn)染血小板因子4組小鼠血清中人VEGF含量降低，轉(zhuǎn)染17-70cDNA組降低更加明顯(P＜0.05)。3種多發(fā)性骨髓瘤動(dòng)物模型的小鼠生存期經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，轉(zhuǎn)染空載體組小鼠生存期最短，和其它組小鼠生存期差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：成功篩選

8、出穩(wěn)定表達(dá)PF4基因或其17-70cDNA片段的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株，經(jīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染PF4全長(zhǎng)cDNA或其17-70cDNA片段均有抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞分泌VEGF的作用，轉(zhuǎn)染PF4的17-70cDNA片段抑制作用更強(qiáng)。成功從健康成人外周血中分離培養(yǎng)出內(nèi)皮祖細(xì)胞。穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染PF4全長(zhǎng)cDNA或其17-70cDNA片段的多發(fā)性骨髓瘤在體外研究中對(duì)人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移有抑制作用。轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染PF4全長(zhǎng)cDNA或其17-70cDNA片段的多發(fā)