5-6腎切除大鼠腎臟血管內皮細胞轉分化及netrin-1腎臟保護作用的研究.pdf

1、盡管腎臟疾病的根底疾病不同：腎小球腎炎、糖尿病腎病、高血壓腎病、藥物性腎病等，但一旦腎臟損傷達到一定程度，腎臟疾病的進程多是進行性的，不可逆的，獨立于原發(fā)損害。腎間質的纖維化(renal interslitial fibrosis，RIF)、管周毛細血管網的丟失，進而腎小管的萎縮、腎小球的硬化是終末期腎病(end-stagerenal disease，ESRD)的共同途徑。以往針對腎間質纖維化的研究，多集中于腎小管上皮細胞、間質細胞活化

2、、粘附因子的表達、炎癥細胞的浸潤。近年來腎臟微血管內皮細胞的損傷和修復，微血管病變和腎間質慢性缺氧及纖維化的關系已經得到國內外學者的共識。腎間質微血管主要指源于出球小動脈并分布于腎小管周圍的毛細血管，即腎小管周圍毛細血管(Peritubular capillary，PTC)，腎小管周圍毛細血管在維持腎小管正常的結構和功能起關鍵作用。近年來的研究提出，在多種腎病中，無論病因如何，均存在腎間質微血管病變，PTC分布紊亂減少，而且PTC減少程

3、度與腎間質纖維化呈正相關。因此如何解決PTC丟失，保護腎臟微血管內皮細胞是治療腎間質纖維化的重要環(huán)節(jié)。
　　 肌成纖維細胞的超微結構介于成纖維細胞和平滑肌細胞之間，比普通的成纖維細胞具有更強的增殖和分泌膠原的能力，是促成腎臟及其它器官纖維化的重要因素，而且其在纖維化部位持續(xù)存在。近來發(fā)現在心肌纖維化和肺纖維化過程中，內皮細胞可以向肌成纖維細胞轉分化(endothelial-myofibroblast transition，End

4、oMT)發(fā)揮了重要作用。在慢性腎臟病進展過程中是否存在內皮細胞向肌成纖維細胞的轉化，從而加重腎間質纖維化的發(fā)生發(fā)展，這是向腎臟工作者提出的新的研究方向。
　　 Netrin-1是Serafini1994年發(fā)現的一種主要的神經軸突導向因子，它是層粘連蛋白樣分子，具有明確的主要組織區(qū)域，屬于層粘連相關家族中的軸突導向分子。在神經系統中其經典的作用是通過與其受體DCC和UNC5H結合引導神經軸突的生長與誘導生長錐的的遷移。近來有學者發(fā)

5、現，由于神經和血管分支走向的高度相似性，引導神經定向生長的軸突導向因netrin-1也能誘導血管的新生。體內、體外的研究表明netrin-1是內皮細胞的促有絲分裂原，能夠促進內皮細胞遷移和增殖，發(fā)揮誘導血管新生的作用，netrin-1是白細胞吸引的潛在抑制劑，能夠抑制粘膜缺氧導致的炎癥反應。為應用netrin-1保護血管內皮細胞，修復PTC，改善腎間質纖維化，延緩腎臟病進展提供契機。
　　 5/6腎切除的典型病理改變?yōu)槟I小球硬化

6、、腎間質纖維化，表現與人類腎臟纖維化相一致的病理過程。是研究慢性腎臟病、腎纖維化的理想動物模型。
　　 本實驗從以下三個方面進行了研究：①netrin-1在正常大鼠腎臟的表達定位、在5/6腎切除中大鼠腎組織中的變化及其與管周毛細血管網之間的關系；②腎臟血管內皮細胞是否可以向肌成纖維細胞轉分化；③netrin-1對5/6腎切除大鼠腎臟的保護作用及可能機制。
　　 材料與方法：
　　 第一部分：雄性SD大鼠48只，隨

7、機分為2組：①模型組(n=24只)大鼠行10％水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml/kg)后，俯臥位固定于手術臺上，從距左脊肋骨1.5厘米處斜向外方切口，暴露左腎，分離腎周圍脂肪囊后，弧行切除腎上下極各1/3，用明膠海綿壓迫止血1分鐘，復位腎臟，縫合。1周后切除整個右腎，2次共切除5/6腎臟；于造模后第4、8、12周分別處死大鼠8只。②假手術對照組(n=24只)僅以水合氯醛腹腔注射麻醉后暴露并剝離腎包膜，不做腎切除。于造模后第4、8、12周分別

8、處死大鼠8只。大鼠在處死前留24小時尿蛋白定量，處死時留取血及腎組織標本。血標本作血尿素氮、血清肌酐檢測；尿標本行24小時尿蛋白定量；腎組織石蠟切片常規(guī)HE和Masson染色觀察腎臟組織病理改變，電鏡觀察腎小管周圍血管內皮細胞的超微結構變化。應用免疫組織化學技術觀察各組、各時間點大鼠腎組織netrin-1、PTC密度、HIF-1α表達情況；Western blot技術檢測netrin-1、HIF-1α蛋白的表達。
　　 第二部分

9、：16只雄性SD大鼠只隨機分為2組：①手術組(n=8只)大鼠行10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml/kg)后，俯臥位固定于手術臺上，從距左脊肋骨1.5厘米處斜向外方切口，暴露左腎，分離腎周圍脂肪囊后，弧行切除腎上下極各1/3，用明膠海綿壓迫止血1分鐘，復位腎臟，縫合。1周后切除整個右腎，2次切除5/6腎臟。②假手術對照組(n=8只)僅以水合氯醛注射麻醉后暴露并剝離腎包膜，不做腎切除。于造模后第12周處死大鼠，留取腎組織石蠟切片常規(guī)HE和M

10、asson染色觀察腎臟組織病理改變；腎組織冰凍切片行CD31、α-SMA間接免疫熒光雙染色后應用共聚焦顯微鏡觀察腎臟血管內皮細胞轉分化的情況。
　　 第三部分：32只雄性SD大鼠，隨機分為3組：①治療組12只，大鼠行10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml/kg)后，俯臥位固定于手術臺上，從距左脊肋骨1.5厘米處斜向外方切口，暴露左腎，分離腎周圍脂肪囊后，弧行切除腎上下極各1/3，用明膠海綿壓迫止血1分鐘，復位腎臟，縫合。1周后切除整

11、個右腎，共切除5/6腎臟；于第2次手術同時腎靜脈注射裸質粒pCMV-NETRIN-1-IRES2-EGFP(100μg，0.2ml)，按文獻方法注射前左腎動、靜脈同時鉗夾，在2秒鐘內注射完畢，術后第12周外死大鼠。②模型組12只，大鼠行10%水合氯醛麻醉(3ml/kg)后，俯臥位固定于手術臺上，從距左脊肋骨1.5厘米處斜向外方切口，暴露左腎，分離腎周圍脂肪囊后，弧行切除腎上下極，用明膠海綿壓迫止血1分鐘，復位腎臟，縫合。1周后切除整個右

12、腎，2次切除5/6腎臟；行第2次手術同時于左腎靜脈注入質粒IRES2-EGFP(100μg，0.2ml)，方法同上。③假手術對照組12只，僅以水合氯醛注射麻醉后暴露并剝離腎包膜，不做腎切除，行第2次手術同時于左腎動脈注入等量的生鹽水(0.2 ml)。治療組及模型組于質粒轉染后1、4、8、12周各處死1只大鼠，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。術后第12周處死大鼠，大鼠在處死前留尿測24小時尿蛋白定量，處死時留取血行腎功檢查。腎標本

13、做HE和Masson染色觀察netrin-1治療后腎臟組織形態(tài)學變化情況。腎組織冰凍切片行CD31、α-SMA間接免疫熒光雙染色后應用共聚焦顯微鏡觀察腎臟血管內皮細胞轉分化的情況。采用免疫組化方法檢測治療前后管周毛細血管密度的改變；PT-PCR方法檢測治療前后netrin-1、MCP-1、HIF-1α的mRNA表達變化；Western blot技術檢測治療前后netrin-1、MCP-1、HIF-1α的蛋白表達變化。數據處理：采用SPS

14、S12.0統計軟件分析處理，計量數據X±s，組間差異采用單因素方差分析，P<0.05為有顯著性差異。
　　 結果
　　 第一部分：①一般狀態(tài)觀察：假手術組表現機警，反應快，皮毛致密、整齊而有光澤，生長、進食及活動情況均無明顯異常。模型組從術后4周起出現明顯營養(yǎng)不良，精神萎靡、活動遲緩，食欲不振、皮毛蓬松、枯槁無光澤，體重增長緩慢，第11周時足部出現不同程度水腫，各組大鼠體質量隨時間的延長而增加。各組組內4、8、12周相比

15、，差異均有統計學意義(P均<0.05)。與假手術大鼠體重相比，第8、12周模型組體重明顯減少(P<0.05)。②生化指標檢查結果：模型組第4周開始，BUN和Scr開始升高，與假手術相比有顯著差異(P<0.01)，第8周和12周呈逐漸升高趨勢，與對照組相比均有顯著性差異(P<0.01)，模型組第4、8、12周，尿蛋白逐漸升高，與假手術相比，均有顯著性差異(P<0.01)。③大鼠腎臟的病理變化：假手術組4、8、12周腎小球腎小管基本正常，腎

16、間質相對面積分別為0.022±0.004，0.025±0.003，0.028±0.012；模型組第4周出現系膜增生，間質內見單核細胞、淋巴細胞浸潤，腎間質相對面積0.123±0.042；模型組第8周腎小球系膜系膜重度增生，細胞增多，腎小球囊壁增厚、間質增寬，纖維組織增多，輕度纖維化，腎間質相對面積為0.265±0.065；模型組第12周腎小球球囊粘連，出現局灶性節(jié)段灶硬化的腎小球硬化，腎小管灶狀萎縮和代償性腎間質纖維化，腎間質相對面積為

17、0.472±0.093。電鏡檢查假手術組內皮細胞結構正常，模型組逐漸出現線粒體空泡樣變性，基底膜厚薄不均，模糊，局部出現斷裂。④腎臟管周毛細血管密度的改變：應用免疫組織化學染包CD34蛋白陽性表達為棕黃色，位于管周毛細血管網內皮細胞及腎小球毛細血管網，通過CD34計算出PTC密度。假手術組4、8、12周PTC分別為41.96±5.08/0.13mm2、42.65±6.32/0.13 mm2、43.61±6.94/0.13mm2，模型組分

18、別30.25±5.62/0.13mm2、17.28±3.61/0.13mm2、5.06±1.37/0.13 mm2。⑤大鼠腎臟組織Netrin-1，HIF-1α蛋白表達定位及蛋白表達的改變：免疫組織化學結果顯示netrin-1蛋白陽性表達為棕黃色，位于腎小管細胞的胞漿中。假手術組腎小管胞漿大量表達netrin-1，IOD分別為(48.36±12.54)×103、(45.69±10.25)×103、(43.94±11.82)×103。在以

19、后的時間點模型組第4周可見netrin-1表達減少，IOD值為(31.62±6.51)×103，第8周(18.67±4.02)×103、12周表達進一步減少，IOD值為(6.31±2.01)×103，與假手術組相比，P值均<0.01。HIF-1α表達于細胞核，在假手術組各時間點，幾乎無表達。模型組于第8周開始表達增強，于假手術相比P值均<0.01。應用Western blotting方法表明netrin-1在假手術組中均為高表達，而在模

20、型組表達逐漸下降。HIF-1α蛋白在假手術組及模型組第4周幾乎無表達，在模型組第8、12周表達明顯增加。
　　 第二部分：內皮細胞向成纖維細胞轉分化的鑒定①假手術對照組中CD31于腎小球及腎間質毛細血管內廣泛表達。α-SMA主要在小動脈壁表達，腎小球和腎小管間質偶見陽性表達。②手術組CD31于腎小球和腎間質毛細血管中仍表達，因腎小球硬化及腎間質血管減少而表達減少。α-SMA在手術組腎小球內可見陽性表達，尤其以腎小球血管極多見，腎

21、小管和間質均可以見到大量表達。⑧CD31和α-SMA共表達為黃色熒光信號。假手術組未見。而模型組見部分α-SMA陽性的間質細胞同時表達CD31，二者共定位的部位呈黃色顆粒。
　　 第三部分：①腎功能測定結果：模型組BUN、Scr逐漸升高，第12周分別為31.26±7.83 mmol/L、141.8±27.6μmol/L，與假手術對照組比較有統計學意義P<0.01；治療組BUN、Scr明顯降低為18.14±4.59 mmol/L、

22、114.7±37.2μmol/L，與模型組比較有統計學意義，P<0.01，但仍高于假手術對照組，差異有統計學意義P<0.01。②24小時尿蛋白結果：模型組第12周尿蛋白升高，與假手術對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；治療組24小時尿蛋白升高，與假手術對照組比較差(P<0.01)；模型組與治療組相比無顯著性差異(P>0.05)。③腎臟病理學檢查發(fā)現模型組損傷嚴重，腎間質纖維化明顯，腎間質纖維化面積為0.487±0.140，治療組

23、腎臟損傷減輕，纖維化程度降低，纖維化面積為0.272±0.009，與假手術對照組和治療組相比，模型組大鼠腎間質纖維化面積明顯增加P<0.01。④內皮細胞轉分化的鑒定：間接免疫熒光染色共聚焦顯微鏡觀察可見治療組CD31和α-SMA共表達明顯少于模型組。⑤腎臟管周毛細血管網的改變：免疫組化染色顯示CD34蛋白陽性表達為棕黃色，位于管周毛細血管網內皮細胞及腎小球毛細血管網，通過CD34計算出PTC密度。假手術組、模型組、治療組的PTC分別為4

24、2.39±4.76/0.13 mm2、4.98±2.01/0.13 mm2、18.31±3.72/0.13 mm2。治療組的PTC明顯高于模型組，但仍低于假手術組，P均<0.01。⑥腎臟組織Netrin-1、MCP-1、HIF-1α蛋白表達的改變：治療組Netrin-1陽性表達較模型組明顯增多，模型組表達減少，甚至完全缺乏，P<0.01；治療組腎臟MCP-1少量表達，模型組腎小管腎小球及間質MCP-1表達明顯增強，表達量高于治療組和假手

25、術對照組P<0.05。治療組腎臟HIF-1α陽性表達比模型組明顯減弱，但仍明顯高于正常組P均<0.01。以上指標腎臟免疫印跡分析顯示了同樣的變化趨勢。⑦腎臟組織Netrin-1、MCP-1、HIF-1α基因表達的改變：治療組腎臟Netrin-1的mRNA表達水平較模型組增加，與模型組相比P<0.01；治療組腎臟MCP-1的mRNA表達水平較模型組下降，P<0.01；治療組腎臟MCP-1的mRNA表達水平較模型組下降，P<0.01。

26、>　　 結論
　　 本研究結果表明：
　　 (1)Netrin-1在大鼠的腎小管上皮細胞胞漿內表達，在5/6腎切除的腎組織中netrin-1隨著腎臟纖維化的進展逐漸減少。
　　 (2)5/6腎切除大鼠的殘腎組織中PTC密度隨疾病進展逐漸減少，在殘腎組織netrin-1表達下降和PTC的減少成正相關。netrin-1在殘腎組織中表達下降，可能是管周毛細血管網減少的原因之一。
　　 (3)Netrin-1基