TEP1在抗瘧藥-硝喹誘導(dǎo)按蚊黑化反應(yīng)中機(jī)理的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、隨著瘧原蟲(chóng)對(duì)抗瘧藥和蚊蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑抗性的出現(xiàn),而且瘧原蟲(chóng)抗原的多態(tài)性、宿主免疫逃避等原因,致使有效瘧疾疫苗的缺乏,至此沒(méi)有完全有效根治瘧疾的措施。抗瘧藥主要研究不同藥物對(duì)不同期瘧原蟲(chóng)的作用,對(duì)于預(yù)防藥是否、如何影響按蚊抗瘧原蟲(chóng)免疫反應(yīng)并不清楚。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),抗瘧藥物-硝喹能誘導(dǎo)斯氏按蚊對(duì)約氏瘧原蟲(chóng)的黑化,啟動(dòng)按蚊對(duì)瘧原蟲(chóng)的免疫反應(yīng),從而阻斷瘧原蟲(chóng)在蚊體內(nèi)的發(fā)育,但是如何識(shí)別、誘導(dǎo)的機(jī)制不清楚。我們研究的目的是認(rèn)識(shí)抗瘧藥物(硝喹)既能

2、對(duì)瘧原蟲(chóng)有殺傷作用,又能誘導(dǎo)按蚊產(chǎn)生對(duì)瘧原蟲(chóng)的黑化免疫反應(yīng),瘧原蟲(chóng)終止在蚊體的發(fā)育,使按蚊不能發(fā)揮作為傳播媒介的作用。 按蚊黑化包被反應(yīng)中的識(shí)別機(jī)制的探討是目前研究瘧原蟲(chóng)-蚊媒相互關(guān)系分子機(jī)制的一個(gè)非常活躍的領(lǐng)域。最近研究表明含硫酯鍵蛋白(thioester-containingprotein,TEP1)能顯著地影響岡比亞按蚊的黑化瘧原蟲(chóng)的能力,那么TEP分子是否在抗瘧藥誘導(dǎo)按蚊黑化反應(yīng)中也有作用、并且發(fā)揮關(guān)鍵的識(shí)別作用。因此,

3、本課題利用斯氏按蚊-約氏瘧原蟲(chóng)模型,從藥物干預(yù)的角度探討按蚊是如何識(shí)別瘧原蟲(chóng),啟動(dòng)按蚊抗瘧原蟲(chóng)的免疫反應(yīng)。 研究結(jié)果如下: 1、根據(jù)果蠅TEP1-4及岡比亞按蚊TEP1分子的保守氨基酸序列比對(duì)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,成功地克隆了4種斯氏按蚊TEP分子,并分別命名為AsTEP1-4。 2、利用Real-timePCR方法研究了AsTEP1-4隨按蚊吸血、感染瘧原蟲(chóng)、以及抗瘧藥物誘導(dǎo)條件下的轉(zhuǎn)錄變化情況。結(jié)果顯示AsTEP1在

4、動(dòng)合子穿過(guò)蚊胃上皮細(xì)胞的時(shí)期(感染24h)和卵囊形成初期(感染4d和5d)表達(dá)上調(diào),以后其表達(dá)下降,而抗瘧藥物-硝喹可以誘導(dǎo)AsTEP1表達(dá)上調(diào),并從用藥后第3d(感染9d后)開(kāi)始,AsTEP1的轉(zhuǎn)錄顯著性高于未用藥組的AsTEP1水平。結(jié)合抗瘧藥誘導(dǎo)按蚊黑化瘧原蟲(chóng)的觀察顯示,用藥后第3d瘧原蟲(chóng)卵囊開(kāi)始出現(xiàn)黑化,這與抗瘧藥誘導(dǎo)AsTEP1表達(dá)明顯上調(diào)的時(shí)相點(diǎn)一致,表明抗瘧藥誘導(dǎo)按蚊抗瘧原蟲(chóng)黑化反應(yīng)可能與抗瘧藥誘導(dǎo)AsTEP1轉(zhuǎn)錄上調(diào)具有

5、相關(guān)性。其它AsTEPcDNAs在以上條件下轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯變化,提示AsTEP2-4與按蚊抗瘧原蟲(chóng)免疫以及抗瘧藥物誘導(dǎo)按蚊免疫反應(yīng)無(wú)相關(guān)性。 3、觀察AsTEP1對(duì)抗瘧藥干擾后斯氏按蚊體內(nèi)約氏瘧原蟲(chóng)的識(shí)別結(jié)合作用。光鏡觀察發(fā)現(xiàn)給藥后3d,與對(duì)照組相比,用藥組卵囊出現(xiàn)明顯的黑化現(xiàn)象,卵囊形態(tài)各異、皺縮,囊壁與內(nèi)容物間隙加大,甚至有內(nèi)容物滲出,沉積的黑色顆粒增多,卵囊顏色漸漸變?yōu)榛液谏?,最后完全被黑色顆?;驁F(tuán)塊物質(zhì)填充即為完全黑化。共聚

6、焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)用藥組卵囊隨黑色顆粒的增多,瘧原蟲(chóng)自帶的GFP熒光信號(hào)逐漸減弱,直至消失;TEP1信號(hào)不僅在用藥組黑化卵囊表面有顯示,而且在黑色顆粒沉積處也有顯示。說(shuō)明AsTEP1可能直接參與了抗瘧藥誘導(dǎo)按蚊黑化相關(guān)成分的募集或者間接地參與激活黑化級(jí)聯(lián)反應(yīng)。 4、通過(guò)喂飼抗AsTEP1抗血清,觀察與黑化表型相關(guān)PO酶的活性變化以及抗瘧藥誘導(dǎo)按蚊黑化反應(yīng)的變化情況。結(jié)果顯示喂飼抗按蚊TEP1的抗血清能使按蚊的PO酶活性以及按蚊的黑

7、化率顯著降低,說(shuō)明抗AsTEP1抗血清進(jìn)入蚊血淋巴抑制了該分子與瘧原蟲(chóng)表面成分或者與下游成分的的結(jié)合,從而影響了AsTEP1分子調(diào)節(jié)的黑化免疫反應(yīng)。提示AsTEP1與抗瘧藥誘導(dǎo)按蚊抗瘧原蟲(chóng)黑化反應(yīng)具有相關(guān)性。 研究結(jié)果表明,本課題成功克隆了4種斯氏按蚊TEPcDNA,其中AsTEP1與按蚊感染瘧原蟲(chóng)以及抗瘧藥物誘導(dǎo)按蚊免疫反應(yīng)相關(guān)。進(jìn)一步分析AsTEP1在抗瘧藥物-硝喹誘使按蚊黑化反應(yīng)中的機(jī)理:斯氏按蚊是約氏瘧原蟲(chóng)的易感蚊種,而

8、硝喹可以影響斯氏按蚊抗約氏瘧原蟲(chóng)免疫反應(yīng),誘導(dǎo)AsTEP1轉(zhuǎn)錄上調(diào),從而改變斯氏按蚊對(duì)約氏瘧原蟲(chóng)的易感性,使得按蚊免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別瘧原蟲(chóng)并引發(fā)黑化免疫反應(yīng),阻止瘧原蟲(chóng)在蚊體內(nèi)的正常發(fā)育。本課題對(duì)AsTEP1在抗瘧藥物誘導(dǎo)按蚊黑化免疫反應(yīng)中的識(shí)別作用的探討為硝喹啟動(dòng)按蚊抗瘧原蟲(chóng)免疫反應(yīng)提供了理論依據(jù),為現(xiàn)場(chǎng)預(yù)防藥物的選擇提供了重要的信息。這既對(duì)發(fā)展有效瘧疾媒介控制策略和現(xiàn)有藥物的更合理使用有意義,又對(duì)抗瘧藥物的設(shè)計(jì)提供了一條非常有意義的途

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