TEP1在抗瘧藥-硝喹誘導按蚊黑化反應(yīng)中機理的研究.pdf

1、隨著瘧原蟲對抗瘧藥和蚊蟲對殺蟲劑抗性的出現(xiàn)，而且瘧原蟲抗原的多態(tài)性、宿主免疫逃避等原因，致使有效瘧疾疫苗的缺乏，至此沒有完全有效根治瘧疾的措施?？汞懰幹饕芯坎煌幬飳Σ煌诏懺x的作用，對于預防藥是否、如何影響按蚊抗瘧原蟲免疫反應(yīng)并不清楚。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，抗瘧藥物-硝喹能誘導斯氏按蚊對約氏瘧原蟲的黑化，啟動按蚊對瘧原蟲的免疫反應(yīng)，從而阻斷瘧原蟲在蚊體內(nèi)的發(fā)育，但是如何識別、誘導的機制不清楚。我們研究的目的是認識抗瘧藥物(硝喹)既能

2、對瘧原蟲有殺傷作用，又能誘導按蚊產(chǎn)生對瘧原蟲的黑化免疫反應(yīng)，瘧原蟲終止在蚊體的發(fā)育，使按蚊不能發(fā)揮作為傳播媒介的作用。 按蚊黑化包被反應(yīng)中的識別機制的探討是目前研究瘧原蟲-蚊媒相互關(guān)系分子機制的一個非?；钴S的領(lǐng)域。最近研究表明含硫酯鍵蛋白(thioester-containingprotein，TEP1)能顯著地影響岡比亞按蚊的黑化瘧原蟲的能力，那么TEP分子是否在抗瘧藥誘導按蚊黑化反應(yīng)中也有作用、并且發(fā)揮關(guān)鍵的識別作用。因此，

3、本課題利用斯氏按蚊-約氏瘧原蟲模型，從藥物干預的角度探討按蚊是如何識別瘧原蟲，啟動按蚊抗瘧原蟲的免疫反應(yīng)。 研究結(jié)果如下： 1、根據(jù)果蠅TEP1-4及岡比亞按蚊TEP1分子的保守氨基酸序列比對設(shè)計簡并引物，成功地克隆了4種斯氏按蚊TEP分子，并分別命名為AsTEP1-4。 2、利用Real-timePCR方法研究了AsTEP1-4隨按蚊吸血、感染瘧原蟲、以及抗瘧藥物誘導條件下的轉(zhuǎn)錄變化情況。結(jié)果顯示AsTEP1在

4、動合子穿過蚊胃上皮細胞的時期(感染24h)和卵囊形成初期(感染4d和5d)表達上調(diào)，以后其表達下降，而抗瘧藥物-硝喹可以誘導AsTEP1表達上調(diào)，并從用藥后第3d(感染9d后)開始，AsTEP1的轉(zhuǎn)錄顯著性高于未用藥組的AsTEP1水平。結(jié)合抗瘧藥誘導按蚊黑化瘧原蟲的觀察顯示，用藥后第3d瘧原蟲卵囊開始出現(xiàn)黑化，這與抗瘧藥誘導AsTEP1表達明顯上調(diào)的時相點一致，表明抗瘧藥誘導按蚊抗瘧原蟲黑化反應(yīng)可能與抗瘧藥誘導AsTEP1轉(zhuǎn)錄上調(diào)具有

5、相關(guān)性。其它AsTEPcDNAs在以上條件下轉(zhuǎn)錄無明顯變化，提示AsTEP2-4與按蚊抗瘧原蟲免疫以及抗瘧藥物誘導按蚊免疫反應(yīng)無相關(guān)性。 3、觀察AsTEP1對抗瘧藥干擾后斯氏按蚊體內(nèi)約氏瘧原蟲的識別結(jié)合作用。光鏡觀察發(fā)現(xiàn)給藥后3d，與對照組相比，用藥組卵囊出現(xiàn)明顯的黑化現(xiàn)象，卵囊形態(tài)各異、皺縮，囊壁與內(nèi)容物間隙加大，甚至有內(nèi)容物滲出，沉積的黑色顆粒增多，卵囊顏色漸漸變?yōu)榛液谏?，最后完全被黑色顆粒或團塊物質(zhì)填充即為完全黑化。共聚

6、焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)用藥組卵囊隨黑色顆粒的增多，瘧原蟲自帶的GFP熒光信號逐漸減弱，直至消失；TEP1信號不僅在用藥組黑化卵囊表面有顯示，而且在黑色顆粒沉積處也有顯示。說明AsTEP1可能直接參與了抗瘧藥誘導按蚊黑化相關(guān)成分的募集或者間接地參與激活黑化級聯(lián)反應(yīng)。 4、通過喂飼抗AsTEP1抗血清，觀察與黑化表型相關(guān)PO酶的活性變化以及抗瘧藥誘導按蚊黑化反應(yīng)的變化情況。結(jié)果顯示喂飼抗按蚊TEP1的抗血清能使按蚊的PO酶活性以及按蚊的黑

7、化率顯著降低，說明抗AsTEP1抗血清進入蚊血淋巴抑制了該分子與瘧原蟲表面成分或者與下游成分的的結(jié)合，從而影響了AsTEP1分子調(diào)節(jié)的黑化免疫反應(yīng)。提示AsTEP1與抗瘧藥誘導按蚊抗瘧原蟲黑化反應(yīng)具有相關(guān)性。 研究結(jié)果表明，本課題成功克隆了4種斯氏按蚊TEPcDNA，其中AsTEP1與按蚊感染瘧原蟲以及抗瘧藥物誘導按蚊免疫反應(yīng)相關(guān)。進一步分析AsTEP1在抗瘧藥物-硝喹誘使按蚊黑化反應(yīng)中的機理：斯氏按蚊是約氏瘧原蟲的易感蚊種，而

8、硝喹可以影響斯氏按蚊抗約氏瘧原蟲免疫反應(yīng)，誘導AsTEP1轉(zhuǎn)錄上調(diào)，從而改變斯氏按蚊對約氏瘧原蟲的易感性，使得按蚊免疫系統(tǒng)能夠識別瘧原蟲并引發(fā)黑化免疫反應(yīng)，阻止瘧原蟲在蚊體內(nèi)的正常發(fā)育。本課題對AsTEP1在抗瘧藥物誘導按蚊黑化免疫反應(yīng)中的識別作用的探討為硝喹啟動按蚊抗瘧原蟲免疫反應(yīng)提供了理論依據(jù)，為現(xiàn)場預防藥物的選擇提供了重要的信息。這既對發(fā)展有效瘧疾媒介控制策略和現(xiàn)有藥物的更合理使用有意義，又對抗瘧藥物的設(shè)計提供了一條非常有意義的途