靶向PI3K短發(fā)卡RNA干擾防治血管移植術(shù)后再狹窄.pdf

1、本文研究目的：構(gòu)建大鼠Pik3cb短發(fā)卡狀RNA(shRNA)真核表達載體，確定其轉(zhuǎn)染效率；建立SD大鼠頸靜脈分支頸動脈血管移植模型，對建立方法進行改進，并對新生內(nèi)膜細胞來源進行研究；觀察雙位點shRNA靶向沉默Pik3cb對P13K-Akt-mTOR信號通路的影響和其對血管移植術(shù)后再狹窄防治作用。 研究方法：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的Pik3cb基因核苷酸序列，按照shRNA設(shè)計原則，設(shè)計并合成6條shRNA寡核苷酸片段，

2、退火形成雙鏈并克隆導(dǎo)入載體pGenesil-1，進行酶切鑒定和測序，經(jīng)預(yù)實驗后挑選出2條Pik3cb shRNA真核表達載體，分別命名為pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2。建立大鼠頸靜脈分支頸動脈間置模型，并對建立方法進行改進，術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d分別取材，組織切片行α-SM-actin和CD-34免疫組化分析新生內(nèi)膜細胞來源。采用大鼠頸靜脈分支頸動脈間置模型，通過Plu

3、ronicF-127質(zhì)粒緩釋系統(tǒng)在血管吻合完成后進行局部RNA干擾。分6組：A組：正常對照組：25％：Pluronic F-127組；B組：pU6-Pik3cb-shRNA-1組；C組：pU6-Pik3cb-shRNA-2組；D組：1/2(shRNA 1+shRNA 2)組；E組：pGenesil-1質(zhì)粒錯配shRNA組；F組：wortmannin陽性對照組。根據(jù)實驗分組的不同，分別將200μl含有50μg shRNA質(zhì)粒的Pluron

4、ic F-127凝膠，或50μg wortmannin，或空白Pluronic F-127凝膠均勻地涂抹在移植橋血管的周圍。一組局部應(yīng)用pGenesil-1質(zhì)粒錯配shRNA，于術(shù)后1 d、2 d、3 d取材，快速冰凍觀察轉(zhuǎn)染效果。一組術(shù)后3 d取材，實時熒光定量PCR和Western blot測定P13K p110β亞單位mRNA的表達和其下游磷酸化Akt、mTOR和PCNA蛋白表達。另設(shè)1 d、3 d、7 d、14 d、28 d五個

5、觀察點，每組30只SD大鼠，免疫組化檢測磷酸化Akt308、PCNA表達的高低，TUNEL法檢測凋亡細胞的數(shù)目；HE染色觀察內(nèi)膜厚度，新生內(nèi)膜面積。 研究結(jié)果：成功構(gòu)建2條大鼠Pik3cb shRNA真核表達載體。轉(zhuǎn)染移植靜脈，中膜平滑肌細胞(smooth muscle cell，SMC)轉(zhuǎn)染效率達60％，內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染效率達90％以上。成功建立大鼠頸靜脈分支頸動脈間置模型并對手術(shù)方法進行了改進，通過α-SM-actin和CD-3

6、4免疫組化結(jié)果推斷靜脈橋血管新生內(nèi)膜細胞豐要來源于橋血管本身細胞或循環(huán)祖細胞。 pU6-Pik3cb-shRNA和wortmannin轉(zhuǎn)染后72 h Pik3cb mRNA和其下游效應(yīng)分子磷酸化Akt308、磷酸化Akt473、磷酸化mTOR和PCNA蛋白表達均明顯下調(diào)；轉(zhuǎn)染組和陽性對照組mRNA相對表達量與正常對照組相比分別下降了70.3％、51.8％、59.9％和74.8％；轉(zhuǎn)染組和陽性對照組Phospho-Akt(Thr3

7、08)蛋白表達量與正常對照組相比分別下降了88％、80.4％、85.6％并190.5％；轉(zhuǎn)染組和陽性對照組Phospho-Akt(Ser473)蛋白表達量與正常對照組相比分別下降了77.8％、70.8％、74.7％和84.1％；轉(zhuǎn)染組和陽性對照組Phospho-mTOR(Ser2448)蛋白表達量與正常對照組相比分別下降了73.4％、62％、70.5％和80.6％；轉(zhuǎn)染組和陽性對照組PCNA蛋白表達量與正常對照組相比分別下降了61.3％

8、、40.7％、53.3％和76.3％；各組正常對照和陰性對照相比均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。免疫組化磷酸化Akt308顯示各時間點正常對照組和錯配質(zhì)粒組內(nèi)膜和中膜內(nèi)側(cè)陽性細胞較多；轉(zhuǎn)染組和陽性對照組內(nèi)膜和中膜內(nèi)側(cè)陽性細胞明顯減少，在7 d和14 d減少最明顯，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。14 d時轉(zhuǎn)染組和陽性對照組陽性面積百分比分別為0.6％、0.81％、0.73％和0.53％，正常對照組和錯配質(zhì)粒組陽性面積百

9、分比為1.72％和1.66％；28 d時轉(zhuǎn)染組和陽性對照組陽性面積百分比分別為0.72％、0.78％、0.77％和1.08％，正常對照組和錯配質(zhì)粒組陽性百分比為2.19％和2.01％；各時間點正常對照組和錯配質(zhì)粒組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 免疫組化PCNA顯示各時間點正常對照組和錯配質(zhì)粒組內(nèi)膜和中膜內(nèi)側(cè)陽性細胞較多；轉(zhuǎn)染組和陽性對照組內(nèi)膜和中膜內(nèi)側(cè)陽性細胞明顯減少，與轉(zhuǎn)染組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2

10、8 d時轉(zhuǎn)染組和陽性對照組陽性面積百分比分別為0.64％、0.83％、0.72％和1.24％，正常對照組和陰性對照組陽性百分比為2.31％和2.53％；各時間點正常對照組和錯配質(zhì)粒組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 TUNEL法結(jié)果顯示各時間點轉(zhuǎn)染組和陽性對照組內(nèi)膜和中膜內(nèi)側(cè)凋亡細胞明顯增加；14 d時轉(zhuǎn)染組和陽性對照組凋亡細胞陽性面積百分比分別為3.19％、2.56％、2.93％和3.64％，而正常對照組和錯配質(zhì)粒組陽

11、性百分比為1.45％和1.33％；28 d時轉(zhuǎn)染組和陽性對照組陽性面積百分比分別為2.62％、1.93％、2.28％和2.4.5％，正常對照組和錯配質(zhì)粒組陽性百分比為0.66％和0.84％；各時間點正常對照組和錯配質(zhì)粒組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 HE染色顯示術(shù)后1～2 w新生內(nèi)膜細胞增生最為明顯，各時間點轉(zhuǎn)染組血管內(nèi)膜厚度、新生內(nèi)膜面積均較正常對照組和錯配質(zhì)粒組明顯減少(P<0.05)。正常對照組在14 d時內(nèi)膜

12、厚度較1 d增厚了6.8倍，陰性對照組為6.6倍，而轉(zhuǎn)染組在14 d時僅分別增厚了3.8倍、4.5倍和4.1倍；正常對照組在14 d新生內(nèi)膜面積較1 d增加了5.2倍，陰性對照組增加了5.1倍，而轉(zhuǎn)染組在14 d時僅分別增加了2.8倍、4.6倍和3.1倍。陽性對照組內(nèi)膜厚度和新生內(nèi)膜面積在14 d之前一直處于低水平，14 d后因藥物效應(yīng)減弱，內(nèi)膜厚度和新生內(nèi)膜面積逐漸增加。 研究結(jié)論：構(gòu)建的質(zhì)粒載體成功進行RNA干擾實驗，靶向P