分子流行病學(xué)研究-染色體1p22-20q12區(qū)域和PVRL1基因與南方漢族非綜合征型唇腭裂的關(guān)聯(lián).pdf

1、第一部分：染色體1p22和20q12區(qū)域單核苷酸多態(tài)性與非綜合征型唇腭裂的關(guān)聯(lián)
　　背景與目的：
　　非綜合征型唇腭裂（non-syndromiccleftlipwithorwithoutcleftpalate,NSCL/P）是最常見的先天性畸形之一，世界范圍內(nèi)的發(fā)病率約為1‰。大量的研究表明NSCL/P的病因是多因素的，可能由某些遺傳易感因子和環(huán)境風(fēng)險因子共同作用所引起。然而，眾多針對遺傳易感因子的研究間卻存在互不相同的，

2、甚至矛盾的結(jié)果。因此，在不同的人群中驗證此前報道的研究結(jié)果，是定位NSCL/P易感基因的一個必要環(huán)節(jié)。本研究的目的是在中國南方漢族人群染色體1p22和20q12上重復(fù)驗證此前全基因組關(guān)聯(lián)分析（genomewideassociationstudy,GWAS）所發(fā)現(xiàn)的10個單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphisms，SNP）與NSCL/P的關(guān)聯(lián)。
　　材料和方法：
　　圍繞該目的，本研究設(shè)計了兩個

3、交叉驗證結(jié)果的實驗環(huán)節(jié)：一，收集305例NSCL/P患者和356例表型正常的對照者，進(jìn)行病例-對照研究（case-controlstudy）；二，收集176例患兒-健康父母親三人核心家系，進(jìn)行核心家系研究(case-parenttriostudy)。研究采用基質(zhì)輔助激光解析——電離飛行時間質(zhì)譜分析法（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry

4、，MALDI-TOF-MS）對10個此前報道與NSCL/P存在關(guān)聯(lián)的SNP位點進(jìn)行基因分型。應(yīng)用卡方檢驗（chi-squaretest）比較病例組和對照組的等位基因、基因型分布差異；應(yīng)用非條件回歸模型（unconditionallogisticregression）計算的比值比（oddsratio,OR）來預(yù)測等位基因、基因型的NSCL/P相對風(fēng)險度；應(yīng)用傳遞不平衡檢驗（transmissiondisequilibriumtest，TD

5、T）比較等位基因在患兒的分布頻率是否偏離孟德爾傳遞規(guī)律預(yù)期分布頻率。最后，我們合并了此前文獻(xiàn)報道的兩個SNP位點rs560426/1p22和rs13041247/20q12的數(shù)據(jù)于本次研究的數(shù)據(jù)中，采用meta分析評價這兩個位點與NSCL/P的關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)果：
　　染色體1p22區(qū)域的SNP：rs560426、rs2151846和rs61748549與中國南方漢族人群NSCL/P發(fā)病不存在顯著關(guān)聯(lián)；而染色體20q12區(qū)域的

6、SNP：rs6072081、rs17820943、rs13041247、rs11696257和rs6102085均與南方漢族人群唇腭裂發(fā)病存在顯著關(guān)聯(lián)，但是兩個編碼蛋白質(zhì)序列的位點rs56261488和rs121912307則沒有在我們的樣本中檢測出變異。
　　meta分析的結(jié)果顯示在混合的亞洲人群樣本中（包括858個漢族和213個韓國、菲律賓、新加坡三人核心家系；676個漢族NSCL/P病例，和740個漢族正常對照），染色體1p

7、22上的SNPrs560426和染色體20q12上的SNPrs13041247均與NSCL/P發(fā)病存在關(guān)聯(lián)。但是分層meta分析（只包含676個漢族NSCL/P病例和740個正常對照）結(jié)果顯示只有rs13041247與漢族人群NSCL/P發(fā)病存在顯著關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)論：
　　在中國南方漢族人群樣本中，我們用多種方法成功驗證了染色體20q12上的SNP與NSCL/P的關(guān)聯(lián)；但是我們沒有成功驗證另外一個染色體區(qū)域——1p22區(qū)。該

8、區(qū)段的SNP可能未與中國南方漢族人群的NSCL/P發(fā)病風(fēng)險存在顯著關(guān)聯(lián)。
　　第二部分：候選基因關(guān)聯(lián)研究——PVRL1基因與非綜合征型唇腭裂
　　背景與目的：
　　脊髓灰質(zhì)炎病毒受體相關(guān)基因1（poliovirusreceptorrelated-1，PVRL1）在唇裂合并或不合并腭裂/外胚層發(fā)育不良綜合征（cleftlipwithorwithoutcleftpalate/ectodermaldysplasia-1syn

9、drome，CLPED1，OMIM＃225000）中被檢出為致病基因。此外，涉及PVRL1的突變報道也見于不同種族的非綜合征型唇腭裂（non-syndromiccleftlipwithorwithoutcleftpalate，NSCL/P）研究。為研究PVRL1基因是否與南方漢族人群的NSCL/P發(fā)病相關(guān)，我們設(shè)計了一個病例-對照關(guān)聯(lián)研究和一個外顯子測序研究。
　　材料和方法：
　　在病例-對照關(guān)聯(lián)研究階段，總計45個標(biāo)簽單

10、核苷酸多態(tài)性（tagsinglenucleotidepolymorphism，tagSNP）位點在470個NSCL/P病例組和693個正常對照組中應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析——電離飛行時間質(zhì)譜分析法（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOF-MS）進(jìn)行基因分型。應(yīng)用卡方檢驗（chi-squaretest）比較病例組和對照組的等

11、位基因、基因型分布差異；應(yīng)用條件回歸模型（conditionallogisticregression）和t統(tǒng)計量（t-statistic）評價次等位基因的（minorallele）是否存在NSCL/P致病的劑量依賴遺傳效應(yīng)（dose-dependentgeneticeffect）。
　　在外顯子測序階段，我們對PVRL1基因α亞型的編碼序列在45個NSCL/P三人核心家庭（陽性NSCL/P家族史家庭）進(jìn)行直接測序，測序結(jié)果應(yīng)用NC

12、BI的網(wǎng)頁核酸序列比對程序包BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中的PVRL1的mRNA數(shù)據(jù)（NM_002855）進(jìn)行比對尋找突變位點。
　　結(jié)果：
　　在進(jìn)行基因分型的45個SNP中，只有一個SNP——rs7128327顯示了趨向于與NSCL/P發(fā)病存在關(guān)聯(lián)（基因型的卡方檢驗P=0.009567）。但是，在進(jìn)行多重比較的校正之后，這個結(jié)果開始變得沒有顯著性。相似的，隨后的滑動窗口單體型（slidingwindowhaploty