非綜合征性唇腭裂與轉(zhuǎn)化生長因子-α基因的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、目的:先天性唇腭裂是人類最常見的一種先天性發(fā)育畸形，先天性唇腭裂可以分為4型:非綜合征性唇裂伴或不伴腭裂(nonsyndromic cleft lipwith or without palate，NSCI±P)，非綜合征性腭裂(nonsyndromic cleft palate，NSCP)，綜合征性唇裂伴或不伴腭裂，綜合征性腭裂。大多數(shù)患者是散發(fā)的非綜合征性唇腭裂(nonsyndromic cleft lip and palate，NS

2、CLP)，包括NSCL±P和NSCP。唇腭裂畸形不僅會影響患者本人的容貌、功能、心理及社會行為，而且也影響著親屬的心理、家庭結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定、后代的優(yōu)生和整個(gè)人口的素質(zhì)。近百年來，許多學(xué)者對唇腭裂的流行狀況和相關(guān)因素進(jìn)行了廣泛的研究，以認(rèn)識其發(fā)病機(jī)制，尋找早期防治的方法。由于地區(qū)、人種、性別、發(fā)生部位、家族史等差異，唇腭裂有不同的發(fā)生率。我國是世界上先天性唇腭裂患病率較高的國家之一，在中國發(fā)病率僅次于神經(jīng)管畸形，據(jù)調(diào)查得出中國唇腭裂發(fā)生率為1

3、.2-1.4:1,000，跟國外相比較發(fā)病率較高，男女性別比是1.4-1.6:1。大部分綜合征性唇腭裂病因已明確，但NSCLP的發(fā)病機(jī)制迄今仍未明確?，F(xiàn)普遍認(rèn)為NSCLP是多基因與環(huán)境多因素綜合作用的結(jié)果。國外主要通過候選基因法進(jìn)行NSCLP基因定位研究，在不同染色體區(qū)域篩選了幾個(gè)可能易感基因位點(diǎn)，其中包括轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)基因位點(diǎn)。目前基因研究的方法主要有兩種:連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析。有學(xué)者證實(shí)TGF-α/TaqI的特定C2等

4、位基因與NSCLP有相關(guān)性，有部分學(xué)者則沒有得到類似的結(jié)論。大多數(shù)研究以西方人種為研究對象，對亞洲人種的研究較少。本研究以中國西南地區(qū)漢族人群為研究對象，用關(guān)聯(lián)分析的方法分析亞洲和歐美人群中研究較多的TGF-α基因多態(tài)性與中國人NSCIP發(fā)病的關(guān)系，探討NSCLP的發(fā)病機(jī)制。本研究采用基于醫(yī)院的病例對照研究，成組設(shè)計(jì)方法，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)方法，檢測TGF-α/TaqI位點(diǎn)多態(tài)性。方法:收集

5、57名NSCLP患者和27名對照者外周血2ml，置于真空試管中，3％枸櫞酸鈉溶液抗凝，-20℃低溫保存。NSCLP患者中男性45名，女性12名，唇裂13名，唇裂伴腭裂37名，腭裂7名，年齡自3個(gè)月～38歲之間。對照者中口腔頜面外科就診的頜面外傷及感染患者13名、瀘州市獻(xiàn)血者14名為對照組，且家族中無唇腭裂患者，不伴有全身性、系統(tǒng)性和其他遺傳性疾病。采用上海生物工程公司提供的DNA提取試劑盒提取0.2ml.外周血白細(xì)胞基因組。每個(gè)標(biāo)本提取

6、基因組后，都進(jìn)行瓊脂糖電泳，確定提取出基因組后，才進(jìn)行PCR。根據(jù)上海生物工程公司提供的PCR引物退火溫度，反復(fù)試驗(yàn)，調(diào)整PCR反應(yīng)條件至最佳；依據(jù)已發(fā)表的TGF-α基因序列引物，采用PCR技術(shù)以全血DNA為模板，從病例組和對照組中擴(kuò)增目的片段，每個(gè)標(biāo)本PCR后，都進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，確定PCR獲得目的片段后，才進(jìn)行酶切反應(yīng)。用TaqI限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增的基因片段。聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測酶切過的基因片段，確定基因多

7、態(tài)性。統(tǒng)計(jì)分析，整理數(shù)據(jù)，首先把研究對象分為病例組和對照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，后根據(jù)患者其他特征進(jìn)行分組，把病例組唇腭裂患者分別分為唇裂組、唇裂伴腭裂組、單純腭裂組三組，男女兩組，1,2度腭裂、左側(cè)唇腭裂、右側(cè)唇腭裂、雙側(cè)唇腭裂四組，分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對TGF-α/TaqI等位基因頻率進(jìn)行卡方(x2)檢驗(yàn)，分析各等位基因在各組之間分布的差異。結(jié)果:從所有57例NSCLP患者和27例對照者的全血中均可擴(kuò)增出178bp的TGF-α基因的目的片段。

8、在RFLP分析中，發(fā)現(xiàn)在57例NSCLP患者和27例對照者中，TGF-α基因的C1等位基因頻率(79.8％)，C2等位基因頻率(20.2％)和3種基因型頻率C1C2(65.5％)，C1C2(28.5％)，C2C2(6％)，TGF-α基因的等位基因頻率和基因型頻率符合哈迪-溫伯格(Hardy-weinberg)定律。在57例NSCLP病例組中TGF-α基因C1等位基因頻率為76.3％，C2等位基因頻率為23.7％，而在27例對照者中C1等

9、位基因頻率為93.3％，C2等位基因頻率為6.7％。TGF-α基因的C1，C2等位基因頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)在NSCLP組和對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.609，v=1,P=0.106>0.05)?；蚪M中含TGF-α基因C2等位基因的人患NSCLP的可能性大，其比值比(odds ratio，0R)為2.08，其95％的可信區(qū)間(95％CI)為(0.86-3.30)。TGF-α基因的C1，C2等位基因頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)在唇裂組、唇裂伴腭裂

10、組、單純腭裂組三組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.330， v=2，P=0.189>0.05)。TGF-α基因的C1，C2等位基因頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)在男女兩組NSCLP之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.262，v=1，P=0.261>0.05)。TGF-α基因的C1、C2等位基因頻率經(jīng)χ2驗(yàn)在1,2度腭裂、左側(cè)唇腭裂、右側(cè)唇腭裂、雙側(cè)唇腭裂四組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.136，v=3，P=0.162>0.05)。結(jié)論:中國西南地區(qū)漢族人