骨形成蛋白信號(hào)通路在肺動(dòng)脈高壓血管重構(gòu)中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary Arterial Hypertension，PAH)是以肺動(dòng)脈壓力增高為特征的一類疾病,其發(fā)病機(jī)制至今仍不明了。已知血管重構(gòu)是肺動(dòng)脈高壓的重要病理特征,其主要病理改變是血管平滑肌層增厚造成管腔狹窄、閉塞。肺血管重構(gòu)可引起肺動(dòng)脈壓力升高,肺血管阻力增大而加重右心室后負(fù)荷,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致右室肥厚、心力衰竭甚至死亡。延緩肺血管重構(gòu),改善心肺功能是藥物治療肺動(dòng)脈高壓,提高患者生存率的關(guān)鍵靶點(diǎn)。
　　骨形成蛋白(

2、Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)信號(hào)通路與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病密切相關(guān)。骨形成蛋白Ⅱ型受體(BMPR-Ⅱ)基因突變是導(dǎo)致遺傳性肺動(dòng)脈高壓的主要發(fā)病因素,也與特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者有關(guān)。BMP信號(hào)通路失調(diào)被認(rèn)為是肺動(dòng)脈高壓的重要發(fā)病原因。但是BMPR-Ⅱ基因敲除小鼠并不一定發(fā)生肺動(dòng)脈高壓,提示可能另有BMP信號(hào)通路下游效應(yīng)蛋白在發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用,或者存在第二重打擊而觸發(fā)PAH的發(fā)病過程。Id蛋白是BMP信號(hào)

3、通路的主要下游蛋白,在組織發(fā)育,細(xì)胞分化,細(xì)胞周期調(diào)控等方面扮演十分重要的角色。本論文第一章將探討B(tài)MPR-Ⅱ突變對(duì)Id蛋白的影響及其在調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖功能中的作用。
　　藥物治療是目前臨床治療肺動(dòng)脈高壓的主要手段,常用藥物包括前列環(huán)素類藥物,磷酸二酯酶5 (PDE5)抑制藥,內(nèi)皮素(ET)受體抑制藥以及鈣離子通道拮抗藥(CCB)等幾大類,主要通過抑制血管收縮,改善血管舒張功能,延緩血管重構(gòu)和肌化等而發(fā)揮作用,但其療效并不

4、十分滿意。本文在確證BMP信號(hào)通路在調(diào)節(jié)PASMCs增殖功能中起重要作用的基礎(chǔ)上,將從在體和離體兩個(gè)水平進(jìn)一步研究BMP信號(hào)通路在肺動(dòng)脈高壓藥物治療中的作用并探討其作為藥物治療靶點(diǎn)的研究前景。
　　第一章Id蛋白介導(dǎo)BMP對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)
　　第一節(jié)BMPR-Ⅱ介導(dǎo)BMP誘導(dǎo)的Id蛋白表達(dá)
　　研究背景：肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制至今仍不明了。血管重構(gòu)被認(rèn)為是肺動(dòng)脈高壓的重要病理特征,肺小血管肌化可引起肺血管阻力增

5、加,肺動(dòng)脈壓力升高并最終導(dǎo)致失代償性心衰甚至死亡。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)的過度增殖是引起血管重構(gòu)的關(guān)鍵因素。越來越多的研究以肺血管重構(gòu)機(jī)制為關(guān)注點(diǎn),臨床治療也多以改善血管重構(gòu),延緩肺動(dòng)脈高壓病程,提高患者生存率為目的。骨形成蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming Growth

6、Factor，TGF)超家族成員之一。BMP可結(jié)合位于細(xì)胞膜上的絲氨酸/絡(luò)氨酸受體復(fù)合物(由BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ組成),進(jìn)而磷酸化激活胞內(nèi)Smad信號(hào)分子,Smads入核啟動(dòng)下游基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),骨形成蛋白Ⅱ型受體(BMPR—Ⅱ)突變是導(dǎo)致遺傳性肺動(dòng)脈高壓的主要發(fā)病因素,也發(fā)現(xiàn)于25％左右的特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者。在低氧誘導(dǎo)和野百合堿注射誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型也發(fā)現(xiàn)BMPR-Ⅱ表達(dá)下調(diào),BMP信號(hào)通路功能受損。因此,BMP信號(hào)通

7、路被認(rèn)為是PAH發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)節(jié)通路。但是,BMPR-Ⅱ基因敲除小鼠并不一定發(fā)生肺動(dòng)脈高壓,提示BMPR-Ⅱ基因突變可能僅是肺動(dòng)脈高壓發(fā)病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)或易感因素,另有BMP信號(hào)通路下游效應(yīng)蛋白在發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用,或者存在第二重打擊而觸發(fā)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病過程。Id蛋白是BMP信號(hào)通路主要的下游蛋白,包括Id1-Id4四種亞型,其表達(dá)與功能各有不同。Idl和Id3被認(rèn)為主要與血管生理有關(guān)。我們最近研究發(fā)現(xiàn),BMPR-Ⅱ基因缺失雜合型小

8、鼠肺組織Idl蛋白表達(dá)水平低于野生型小鼠,BMP抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖可能與Idl有關(guān),但是Id蛋白在BMP信號(hào)通路中的作用,BMPR-Ⅱ突變對(duì)Id蛋白的影響尚不明了。本研究主要以人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象,探討B(tài)MPR-Ⅱ在介導(dǎo)BMP誘導(dǎo)四種Id蛋白亞型的表達(dá)與功能中的作用。另外基于BMPR-Ⅱ+/-小鼠與野生型小鼠在常氧和低氧狀態(tài)下肺血管Id蛋白表達(dá)的差異,以及BMP信號(hào)通路激活十分迅速,Id蛋白上游Smad蛋白磷酸化在BMP刺

9、激后半小時(shí)左右即可發(fā)生并達(dá)到高峰,我們也觀察了BMP對(duì)Id蛋白調(diào)節(jié)的時(shí)間效應(yīng)。
　　方法：(1)BMPR-Ⅱ+/-小鼠與野生型小鼠肺組織提取及免疫組織化學(xué)分析WKY雄性小鼠,分設(shè)4組(n=5):野生型組(WT).BMPR-Ⅱ基因敲除組(BMPR-Ⅱ+/-).低氧野生型組(Hypoxia+WT).低氧BMPR-Ⅱ基因敲除組(Hypoxia+BMPR-Ⅱ+/-)。肺組織一部分行石蠟包埋,以備免疫組織化學(xué)檢測(cè),一部分采用磁珠分選法分離培

10、養(yǎng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。
　　(2)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng),SiRNA干擾及RNA,蛋白檢測(cè)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞來源于肺移植病人或肺切除術(shù)患者,之前已作BMPR-Ⅱ基因型分析。常規(guī)以含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培基培養(yǎng)。不同因素處理后,提取細(xì)胞總RNA及蛋白進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。SiRNA直接購(gòu)于或合成于公司。
　　結(jié)果：1.BMP可誘導(dǎo)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞四種Id蛋白的表達(dá);
　　2.SiRNA沉默BMPR-Ⅱ表達(dá)取消BMP

11、誘導(dǎo)的Id蛋白表達(dá);
　　3.含BMPR-Ⅱ突變基因的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Idl和Id3表達(dá)明顯低于BMPR-Ⅱ基因野生型正常細(xì)胞;
　　4.Id3蛋白主要表達(dá)于小鼠肺血管平滑肌層;常氧和低氧狀態(tài)下,BMPR-Ⅱ+/-小鼠Id3表達(dá)都明顯低于野生型小鼠;
　　5.BMP誘導(dǎo)Idl和Id3表達(dá)具有短期與長(zhǎng)期兩次效應(yīng);
　　結(jié)論：BMPR-Ⅱ基因缺失抑制了人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Id蛋白的表達(dá),BMPR-Ⅱ介導(dǎo)BMP誘導(dǎo)的I

12、d蛋白表達(dá);BMP誘導(dǎo)Idl和Id3蛋白表達(dá)具有早期和長(zhǎng)期效應(yīng)。
　　第二節(jié)Id蛋白介導(dǎo)BMP對(duì)PASMCs增殖和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)
　　研究背景：Id蛋白是一類轉(zhuǎn)錄因子,屬于莖-環(huán)-莖(Helix-Loop-Helix，HLH)大類。Id蛋白廣泛表達(dá)于人體各個(gè)組織,在胚胎發(fā)育,血管新生,細(xì)胞分化,細(xì)胞周期調(diào)控等多種事件中扮演重要角色。Id基因還被認(rèn)為是促癌基因,是決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因子。研究發(fā)現(xiàn),Id蛋白在增殖細(xì)胞普遍

13、高水平表達(dá),在非增殖細(xì)胞、沉默細(xì)胞表達(dá)量很低甚至缺失,提示Id蛋白參與細(xì)胞增殖功能的調(diào)節(jié)。研究表明,Id蛋白調(diào)控細(xì)胞增殖主要與其調(diào)節(jié)細(xì)胞周期有關(guān),調(diào)節(jié)點(diǎn)位于G1期入S期的時(shí)相階段。細(xì)胞周期依賴性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)的抑制蛋白如p21和p27等是Id蛋白的主要調(diào)控對(duì)象。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖也受BMP信號(hào)通路的調(diào)控,但是具體機(jī)制不明,Id蛋白是否介導(dǎo)這一調(diào)節(jié),其作用是否與調(diào)控細(xì)胞周期有關(guān)等問題都有待

14、解決。本研究著眼于肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖功能的調(diào)控,探討B(tài)MP/Id信號(hào)通路在調(diào)節(jié)PASMCs增殖和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的作用。
　　方法：人PASMCs常規(guī)培養(yǎng),觀察BMP對(duì)細(xì)胞增殖的影響。同時(shí)觀察BMP對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白如p21，p27，pRb的作用。之后以SiRNA干擾沉默Idl和Id3蛋白表達(dá),探討Id蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、PASMCs增殖中的作用。
　　結(jié)果：1.細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示,BMP4抑制野生型肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增

15、殖;
　　2. BMP4對(duì)BMPR-Ⅱ基因突變細(xì)胞增殖無明顯影響;
　　3.Westernblot實(shí)驗(yàn)顯示,BMP4對(duì)PASMCs中P21蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)在野生型細(xì)胞和BMPR-II基因突變細(xì)胞存在差異;
　　4.SiRNA干擾有效抑制Id1和Id3表達(dá);
　　5.Id1和Id3介導(dǎo)了BMP4對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P21和pRb蛋白的作用;
　　結(jié)論：Id1和Id3蛋白對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的調(diào)控可能介導(dǎo)了BMP4對(duì)

16、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　第二章以BMP信號(hào)通路為靶點(diǎn)的藥物治療機(jī)制研究
　　第一節(jié)曲前列素治療肺動(dòng)脈高壓與調(diào)節(jié)BMP信號(hào)通路有關(guān)
　　研究背景：肺動(dòng)脈高壓患者死亡率高,生存率低,至今仍無特效治療方案。除了晚期進(jìn)行肺移植手術(shù)之外,藥物治療仍然是絕大部分肺動(dòng)脈高壓患者的主要治療手段。常用藥物包括前列環(huán)素類藥物,磷酸二酯酶5(Phosphodiesterase 5，PDE5)抑制藥,內(nèi)皮素(Endothelin

17、，ET)受體抑制藥以及鈣離子通道拮抗藥(Calcium channel block，CCB)等幾大類,主要發(fā)揮抑制血管收縮、改善血管舒張功能、延緩血管重構(gòu)和肌化等藥理作用。前列環(huán)素類藥物如曲前列素能在體內(nèi)激活腺苷酸環(huán)化酶(Adenyl cyclase，AC),促進(jìn)環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP)的生成,達(dá)到舒張血管的作用。研究發(fā)現(xiàn),前列環(huán)素類藥物還具有改善肺血管重構(gòu)的作用,但是其作用機(jī)

18、制尚不明確。TGF信號(hào)通路在肺動(dòng)脈高壓發(fā)病過程中的作用至今仍有爭(zhēng)議,一般認(rèn)為其與BMIP信號(hào)通路作用相反,是維持血管穩(wěn)態(tài)平衡的兩個(gè)平衡端。本研究在以野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型,給予曲前列素治療,觀察其對(duì)肺動(dòng)脈壓力、右心室功能、肺小血管肌化及重構(gòu)的影響?；诘谝徽卵芯堪l(fā)現(xiàn)BMP/Id信號(hào)通路在調(diào)節(jié)PASMCs增殖中的作用,本節(jié)也將進(jìn)一步探討曲前列素對(duì)BMP/Id信號(hào)通路及TGF信號(hào)通路的影響及其意義。
　　方法：(1)野百合堿

19、誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠模型及藥物治療:雄性SD品系野生型大鼠,分為三個(gè)組別:對(duì)照組,野百合堿+治療空白對(duì)照組,野百合堿+曲前列素治療組。給予單次皮下細(xì)注射野百合堿(monocrotanine，MCT 60mg/kg)誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓模型。野百合堿注射三周后,背部皮下植入滲透性微泵注射曲前列素治療2周。藥物濃度0.15mg/ml,注射速度為45ng/kg/min。對(duì)照組給予等量等張生理鹽水。微泵植入時(shí)以芬太尼(300ug/kg)與曼陀羅堿(30

20、0ug/kg)麻醉大鼠,術(shù)后30分鐘動(dòng)物復(fù)蘇。
　　(2)動(dòng)物手術(shù)及組織提取:實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)以戊巴比妥麻醉大鼠,行氣管切開呼吸機(jī)維持呼吸。左頸動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)系統(tǒng)血壓,右心導(dǎo)管由右頸靜脈插入,監(jiān)測(cè)右心功能、肺血管阻力等指標(biāo)。動(dòng)物放血后,左肺存于10%福爾馬林以備組織學(xué)實(shí)驗(yàn),右肺速凍于液氮以備RNA、蛋白提取,心臟分離出右心室、左心室加室間隔稱重計(jì)算RV/(LV+S)比值。
　　結(jié)果：1.野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈壓力、右室收縮壓和肺血

21、管阻力明顯增高,血管重構(gòu)明顯,肺小血管肌化比例高,右心室顯著肥厚。曲前列素治療降低肺血管阻力、右室收縮壓,改善血管重構(gòu),肺小血管肌化及右心室肥厚。
　　2.免疫組織化學(xué)分析顯示,野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺組織Id1表達(dá)下調(diào),增殖細(xì)胞增多。曲前列素治療升高了Id1的表達(dá),增殖細(xì)胞數(shù)目明顯減少。
　　3. Westernblot和Real-time PCR實(shí)驗(yàn)顯示,野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺組織BMPR-II蛋白表達(dá)明顯減少,Smad1/5

22、磷酸化水平降低,Id1mRNA水平顯著下調(diào)。曲前列素不能恢復(fù)BMPR-II的表達(dá),但是升高了Smad1/5磷酸化水平及Id1mRNA水平的表達(dá)。
　　4. Westernblot和Real-time PCR實(shí)驗(yàn)顯示,野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺組織Smad3磷酸化水平升高,PAI-1mRNA水平上調(diào)。曲前列素治療降低了Smad3磷酸化水平,抑制了PAI-1mRNA水平的表達(dá)。
　　結(jié)論：曲前列素治療肺動(dòng)脈高壓,改善肺血管重構(gòu)可能與其

23、抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TGFβ信號(hào)通路,激活BMP信號(hào)通路有關(guān)。BMP信號(hào)通路可能是PPH治療的重要靶點(diǎn)。
　　第二節(jié)西地那非抑制PASMCs增殖及其對(duì)BMP信號(hào)通路的調(diào)節(jié)
　　研究背景：BMP信號(hào)通路的調(diào)節(jié)是PAH研究關(guān)注的熱點(diǎn)，但至今所知甚少。新近發(fā)現(xiàn)cGMP依賴性蛋白激酶I (cGMP dependent protein kinase I,cGKI)是調(diào)節(jié)BMP信號(hào)通路的重要蛋白，cGKI可直接結(jié)合于B MPR-I I，

24、促進(jìn)受體配體結(jié)合，之后還可以與Smad結(jié)合，促進(jìn)其磷酸化并一同入核調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)。cGKI在體內(nèi)主要由環(huán)磷酸鳥普(cyclic guanylic acid，cGMP)激活。NO激活鳥營(yíng)酸環(huán)化酶(guanylatecyclase，GC)可生成cGMP，其降解則主要通過磷酸二醋酶水解代謝。磷酸二酷酶抑制藥如西地那非(Sildeanfil)己廣泛用于肺動(dòng)脈高壓治療，其藥理機(jī)制在于抑制cGMP的降解而升高其體內(nèi)濃度，達(dá)到舒張血管、增加血流的目

25、的?；谛陆l(fā)現(xiàn)cGKI是調(diào)節(jié)BMP信號(hào)通路的重要蛋白，可直接結(jié)合并調(diào)節(jié)BMP信號(hào)通路的各個(gè)階段。本節(jié)擬研究西地那非對(duì)PASMCs細(xì)胞增殖的作用，探討其作用是否與升高cGMP生成，激活cGKI，進(jìn)而調(diào)節(jié)BMP信號(hào)通路有關(guān)。目的在于揭示BMP信號(hào)通路在PAH藥物治療中的作用，前瞻性探討 BMP信號(hào)通路作為新的PAH藥物治療靶點(diǎn)的可行性。
　　方法：(1)觀察西地那非對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響:人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)分為5組(

26、n=3):無血清饑餓對(duì)照組:0.1%FBS的DMEM培基;常規(guī)培養(yǎng)對(duì)照組:10%FBS的DMEM培基;BMP4處理組:10ng/ml濃度的BMP4;西地那非處理組:1μM濃度西地那非;BMP4合用西地那非處理組:10ng/ml濃度的BMP4合用1μM濃度西地那非。細(xì)胞按20000/well密度接種于24孔培養(yǎng)板，分別在處理后第1,4,6天計(jì)數(shù)。培基隔天更換。
　　(2)觀察西地那非對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BMP信號(hào)通路的作用:西地那非

27、((1-3 },M)單獨(dú)使用或與BMP4合用孵育人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，采用Real-time PCR和Westernblot等技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞BMP信號(hào)通路中各蛋白的表達(dá)水平。
　　(3)觀察cGMP/cGHI在介導(dǎo)西地那非抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)BMP信號(hào)通路中作用:以cGKI抑制劑Rp-8-Br-PET-cGMPs和SiRNA分別抑制、干擾cGKI的表達(dá)和功能，觀察cGKI被抑制前后西地那非對(duì)PASMCs增殖及BMP信號(hào)通路的

28、影響。
　　結(jié)果：1.西地那非抑制PASMCs增殖，合用BMP4可進(jìn)一步增強(qiáng)BMP4對(duì)PASMCs增殖的抑制作用;
　　2.合用西地那非增強(qiáng)BMP4激活的BMP信號(hào)下游通路;
　　3.合用cGMP內(nèi)源性擬似物8-br-cGMP增強(qiáng)BMP4激活的BMP信號(hào)通路下游通路;
　　4.使用SiRNA干擾沉默cGKI表達(dá)后，BMP4合用西地那非增強(qiáng)PASMCs中BMP信號(hào)通路的作用減弱;
　　5.使用cGKI抑制物R