降脂益肝沖劑對非酒精性脂肪肝大鼠肝組織抵抗素mRNA表達的影響.pdf

1、目的：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD),代表了一組以甘油三酯在肝內(nèi)過度貯積而引起的臨床病理綜合征,其范疇包括單純性脂肪肝(NASFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和NASH相關(guān)性肝硬化。近年研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病率不斷攀高且起病漸趨低齡化,并可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化等終末期肝病。然而,其發(fā)病機制尚不明確,臨床上仍缺乏有效的治療手段。目前認為其屬于代謝綜合征(MS)的范疇,胰島素抵抗及炎癥因子的參與是其發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。抵抗素是一種富含半胱氨酸

2、的分泌性蛋白,因其可影響與胰島素作用相關(guān)的葡萄糖代謝以及脂代謝,具有對抗胰島素的作用而命名。新近發(fā)現(xiàn)它還可作為促炎因子參與炎癥的級聯(lián)反應(yīng),與NASH的發(fā)病關(guān)系密切。本實驗采用高脂膽固醇飲食建立非酒精性脂肪肝大鼠模型,動態(tài)觀察大鼠肝組織中抵抗素mRNA的表達情況,對抵抗素在NAFLD發(fā)病機理中的作用進行初步探討,同時觀察降脂益肝沖劑對肝組織抵抗素mRNA表達的影響,探討其可能的分子治療機制,為其更廣泛的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 方法

3、：1.動物模型的建立及標本的采集：72只雄性Wistar大鼠正常喂養(yǎng)一周后,隨機分為正常對照組(N組)：給予正常飼料；模型對照組(M組),藥物干預(yù)組(D組)：給予高脂飼料(85％普通飼料,13％的豬油和2％的膽固醇),每組24只,分別設(shè)8、13、18周三個時相點,每個時點8只大鼠,相對應(yīng)的組別為N1、N2、N3,M1、M2、M3,D1、D2、D3組。D1、D2、D3組分別于實驗開始、第8周末和第13周末,給予降脂益肝沖劑1ml/100g

4、,以0.8g/ml的濃度溶解灌胃,每日兩次,分別持續(xù)8W,5W,5W。同時M組和N組分別給予等量的生活飲用水灌胃。實驗結(jié)束后分階段處死各組大鼠,自腹主動脈采血,迅速取出肝臟,按常規(guī)制備血清、肝勻漿以及肝組織切片,并留取少量肝組織于-70℃低溫保存。2.檢測指標：測體重、體長、肝脾濕重,并計算肝指數(shù)(肝濕重/體重×100％)、Lee's指數(shù)(體重0.33/體長×1000)及肝脾比值(肝濕重/脾濕重)等體質(zhì)指標；全自動生化分析儀測定丙氨酸轉(zhuǎn)

5、氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血脂及肝組織脂質(zhì)含量,葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖(FBG),銅染色法測定血清和肝組織FFA水平,放免法測定血清空腹胰島素(FINS)和TNF-α水平,計算胰島素敏感指數(shù)(ISI=ln[1/(FINS×FBG)]);比色法測定血清和肝組織GSH含量,黃嘌呤氧化酶法測定血清和肝組織SOD活性；硫代巴比妥酸法測定血清和肝組織MDA含量；光鏡下評估脂肪變性和炎癥活動情況；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR

6、)測定肝組織抵抗素mRNA的表達。 結(jié)果：(1)N組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝索圍繞中央靜脈呈放射狀分布,細胞呈多邊形,大小較一致；各項生化指標均在正常范圍；抵抗素mRNA表達微弱。(2)8周末,模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的脂質(zhì)代謝紊亂,伴隨高胰島素血癥和胰島素抵抗；血清轉(zhuǎn)氨酶水平較正常組明顯升高,TNF-α水平升高；肝組織出現(xiàn)了輕到中度脂肪變,且無炎細胞浸潤；肝臟抵抗素mRNA的表達較其對照組顯著升高。用藥組大鼠血清和肝組織各項指標均明

7、顯改善；肝脂變程度較模型組明顯減輕：肝組織抵抗素mRNA表達顯著降低(P<0.05)。(3)13周末,模型組大鼠胰島素抵抗程度較前無明顯進展；和正常組相比,血脂和肝臟脂質(zhì)含量、血清TNF-α含量、轉(zhuǎn)氨酶水平明顯升高；HDL-C含量明顯降低：肝組織出現(xiàn)中到重度脂肪變,肝小葉內(nèi)炎細胞浸潤和散在的點狀壞死,炎癥活動度計分明顯高于正常組(P<0.01);肝組織抵抗素mRNA表達顯著升高,且與前期相比差異顯著(P<0.01)。用藥組大鼠血清和肝組

8、織各項指標均明顯改善；肝組織抵抗素mRNA表達顯著降低(P<0.01);肝組織脂變程度及炎癥活動度明顯減輕(P<0.05,P<0.01)。(4)18周末,模型組大鼠胰島素抵抗程度較前仍無明顯進展：和正常組相比,血脂和肝臟脂質(zhì)含量、血清TNF-α含量、轉(zhuǎn)氨酶水平明顯升高；HDL-C含量明顯降低；肝組織彌漫性脂肪變性及氣球樣變性,小葉內(nèi)和匯管區(qū)不同程度的炎癥細胞浸潤和壞死；炎癥活動度計分明顯高于正常組(P<0.01);肝組織抵抗素mRNA表

9、達繼續(xù)顯著升高,與前期相比差異顯著(P<0.01)。用藥組大鼠血清和肝組織各項指標均明顯改善；肝組織抵抗素mRNA表達顯著降低(P<0.01);肝組織脂變及氣球樣變程度明顯減輕(P<0.01),炎癥活動度也明顯減輕(P<0.01)。(5)相關(guān)性分析顯示：模型組各時點肝臟抵抗素mRNA水平均與血清TNF-α水平、肝臟炎癥活動度計分呈正相關(guān)(P<0.01或P<0.05)。而與ISI僅在8周末模型組呈負相關(guān)(P<0.01),第13,18周末二

10、者無相關(guān)性。 結(jié)論：1.高脂高膽固醇飲食可以成功復(fù)制NAFLD大鼠模型；胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激\脂質(zhì)過氧化損傷以及炎癥因子如TNF-α紊亂與NAFLD的發(fā)生密切相關(guān)。2.正常大鼠肝臟可表達抵抗素,NAFLD大鼠肝臟抵抗素基因表達上調(diào),且隨造模時間延長表達量顯著增加；相關(guān)性分析提示抵抗素可能通過胰島素抵抗觸發(fā)NASFL的形成,通過對炎癥因子的調(diào)控參與NASH的發(fā)生；并與NAFLD相互促進,形成惡性循環(huán)。3.JYC對NA