降脂益生菌對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠膽汁酸代謝的影響.pdf

1、背景和目的：
　　非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）包含了一些列肝臟病理學(xué)變化，從單純性肝細(xì)胞脂肪沉積到非酒精性脂肪性肝炎，甚至可以發(fā)展為肝硬化或者肝細(xì)胞癌。NAFLD特點(diǎn)是過(guò)多的中性脂質(zhì)沉積在肝細(xì)胞中，導(dǎo)致脂質(zhì)利用與脂質(zhì)排出失衡。目前，NAFLD是世界上最常見(jiàn)的肝病，可影響到25％-30%人群，尤其是，在超重、肥胖及Ⅱ型糖尿病患者中，NAFLD非常普遍。而且，NA

2、FLD與代謝綜合征的特征密切相關(guān)，而表現(xiàn)在肝臟上的這些特征則可增加心臟代謝危險(xiǎn)[1-3]。
　　盡管NAFLD發(fā)病的病理生理學(xué)機(jī)制很復(fù)雜，并且尚未完全清楚[4]，目前多數(shù)研究者認(rèn)為長(zhǎng)期高脂飲食（high fat diet,HFD）、腸道菌群紊亂紊亂參與代謝綜合征的發(fā)病。此外，一系列研究已經(jīng)表明腸道菌群與腸-肝軸之間存在著雙向互動(dòng)即微生物-腸-肝軸，應(yīng)用益生菌干預(yù)則可以減輕肝臟脂肪浸潤(rùn)。然而，在非酒精性脂肪肝中，腸道微生物如何影響腸

3、-肝軸發(fā)揮作用目前也尚未明確。
　　非酒精性脂肪肝主要通過(guò)限制能量攝入、運(yùn)動(dòng)以及藥物等方法治療，但效果均不理想。我們前期研究證實(shí)，給予高脂飲食大鼠降脂益生菌（DM9054+86066菌株）干預(yù)通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群，可降低大鼠血脂水平，改善肝臟脂肪變性，減輕肝臟炎癥及肝細(xì)胞損傷，并且可以上調(diào)腸道FXR mRNA表達(dá)水平。這表明我們篩選的降脂益生菌可能通過(guò)調(diào)控膽汁酸代謝改善動(dòng)物模型高脂血癥及脂肪肝，但其對(duì)膽汁酸代謝的具體影響及機(jī)制仍不清楚

4、。
　　因此，本研究通過(guò)高脂飲食建立NAFLD大鼠模型，研究NAFLD大鼠膽汁酸代謝變化，并探討降脂益生菌如何通過(guò)調(diào)節(jié)膽汁酸代謝改善大鼠非酒精性脂肪肝，為開(kāi)拓NAFLD的新療法提供理論依據(jù)。
　　材料和方法：
　　SPF級(jí)雄性SD大鼠21只（體重180g-200g），適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，隨機(jī)選取7只分別分組為對(duì)照組，模型組，降脂益生菌干預(yù)組。對(duì)照組給予正常飲食，模型組及干預(yù)組給予高脂飲食。對(duì)照組及模型組給予生理鹽水灌胃，

5、干預(yù)組給予2×1010cfu益生菌（DM9054及86066各1×1010cfu）灌胃。建模及干預(yù)時(shí)間均為20周，每周測(cè)體重及飲食量一次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，留取各組大鼠血清、肝臟、回腸組織及糞便。南京建成試劑盒檢測(cè)大鼠血清甘油三酯及膽固醇水平；ELISA檢測(cè)大鼠血清CK-18 M30水平。使用Real Time PCR評(píng)估了CYP7A1、FXR mRNA以及回腸FXR、ASBT、FGF15 mRNA表達(dá)水平。Western blot檢

6、驗(yàn)肝臟CYP7A1、FXR及回腸ASBT蛋白表達(dá)水平。免疫組織化學(xué)法分析肝臟FXR及腸道FXR蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠一般指標(biāo)變化：與對(duì)照組相比，模型組體重明顯增加，血甘油三酯、膽固醇水平升高，血清CK18水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，降脂益生菌干預(yù)后可使大鼠體重減輕，血清甘油三酯、膽固醇及CK18水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.病理變化：與對(duì)照組相

7、比，模型組肝臟HE染色及蘇丹染色可見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞及脂肪浸潤(rùn)，益生菌干預(yù)后肝臟脂肪浸潤(rùn)減輕；回腸HE染色可見(jiàn)模型組小腸絨毛損傷，而益生菌干預(yù)后可使腸絨毛損傷好轉(zhuǎn)。
　　3.大鼠肝臟CYP7A1表達(dá)水平：與對(duì)照組相比，模型組肝臟CYP7A1 mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，干預(yù)組CYP7A1 mRNA表達(dá)量明顯上升(P<0.05)；肝臟CYP7A1蛋白表達(dá)結(jié)果與基因表達(dá)水平一致。
　　4.大鼠肝臟FXR表達(dá)

8、水平：與對(duì)照組相比，模型組肝臟FXR mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，干預(yù)組肝臟FXR mRNA表達(dá)水平明顯降低。Western blot及免疫組化結(jié)果與基因表達(dá)水平一致。
　　5.大鼠腸道FXR-FGF15信號(hào)通路變化：與對(duì)照組相比，模型組腸道FXR，F(xiàn)GF15 mRNA水平降低(P<0.05)；與模型組相比，干預(yù)組腸道FXR，F(xiàn)GF15 mRNA明顯升高(P<0.05)?；啬cFXR免疫組化結(jié)果與基因表達(dá)

9、水平一致。
　　6.大鼠腸道ASBT表達(dá)水平：與對(duì)照組相比，模型組小腸ASBT mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，干預(yù)組小腸ASBT mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。Western blot結(jié)果與基因表達(dá)水平一致。
　　結(jié)論：
　　1.長(zhǎng)期高脂飲食可造成 SD大鼠肝臟脂肪浸潤(rùn)及肝細(xì)胞損傷，降脂益生菌干預(yù)則可改善脂肪肝；
　　2.在非酒精性脂肪肝大鼠模型中，長(zhǎng)期高脂飲食下調(diào)CYP7A