降脂益肝沖劑對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝組織糖類應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ChREBP)mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，代表了一組以甘油三酯在肝內(nèi)過(guò)度貯積而引起的臨床病理綜合征，其范疇包括單純性脂肪肝(NASFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和NASH相關(guān)性肝硬化。目前認(rèn)為其屬于代謝綜合征(MS)的范疇，胰島素抵抗及炎癥因子的參與是其發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。糖類應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ChREBP)是一種與糖類應(yīng)答元件(ChRE)結(jié)合的蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)糖酵解酶和脂肪合成酶相關(guān)基因的表達(dá)，ChREBP通過(guò)對(duì)成脂相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在

2、肝臟脂質(zhì)合成中起重要的決定因子的作用。最近的研究表明ChREBP在非酒精性脂肪肝中表達(dá)增加，并且與胰島素抵抗有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用高脂膽固醇飲食建立非酒精性脂肪肝大鼠模型，動(dòng)態(tài)觀察大鼠肝組織中糖類應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ChREBP)mRNA的表達(dá)情況，對(duì)糖類應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ChREBP)在NAFLD發(fā)病機(jī)理中的作用進(jìn)行初步探討，同時(shí)觀察降脂益肝沖劑對(duì)肝組織糖類應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ChREBP)mRNA表達(dá)的影響，探討其可能的分子治療機(jī)制，為其更廣

3、泛的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1．動(dòng)物模型的建立及標(biāo)本的采集：48只雄性Wistar大鼠正常喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(N組)：給予正常飼料；模型對(duì)照組(M組)，藥物干預(yù)組(D組)：給予高脂飼料(85％普通飼料，13％的豬油和2％的膽固醇)，每組16只，分別設(shè)8、12周兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)點(diǎn)8只大鼠，相對(duì)應(yīng)的組別為N1、N2，M1、M2，D1、D2組。D1、D2組分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始及第8周末，給予降脂益肝沖劑1ml/100g，

4、以0.8g/ml的濃度溶解灌胃，每日兩次，分別持續(xù)8W及4W。同時(shí)M組和N組分別給予等量的生活飲用水灌胃。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分階段處死各組大鼠，自腹主動(dòng)脈采血，迅速取出肝臟，按常規(guī)制備血清、肝勻漿以及肝組織切片，并留取少量肝組織于-70℃低溫保存。 2．檢測(cè)指標(biāo)：測(cè)體重、體長(zhǎng)、肝脾濕重，并計(jì)算肝指數(shù)(肝濕重/體重×100％)、Lee's指數(shù)(體重0.33/體長(zhǎng)×1000)及肝脾比值(肝濕重/脾濕重)等體質(zhì)指標(biāo)；全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定丙氨酸

5、轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血脂及肝組織脂質(zhì)含量，葡萄糖氧化酶法測(cè)定空腹血糖(FBG)，銅染色法測(cè)定血清和肝組織FFA水平，放免法測(cè)定血清空腹胰島素(FINS)和TNF—α水平，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI=ln〔1/(FINS×FBG)〕)；比色法測(cè)定血清和肝組織GSH含量，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清和肝組織SOD活性；硫代巴比妥酸法測(cè)定血清和肝組織MDA含量；光鏡下評(píng)估脂肪變性和炎癥活動(dòng)情況；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PC

6、R)測(cè)定肝組織糖類應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ChREBP)mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：1．N組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀分布，細(xì)胞呈多邊形，大小較一致；各項(xiàng)生化指標(biāo)均在正常范圍；糖類應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ChREBP)mRNA表達(dá)微弱。 2.8周末，模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的脂質(zhì)代謝紊亂，伴隨高胰島素血癥和胰島素抵抗；血清轉(zhuǎn)氨酶水平較正常組明顯升高，TNF—α水平升高；肝組織出現(xiàn)了輕到中度脂肪變，且無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；肝臟糖類應(yīng)

7、答元件結(jié)合蛋白(ChREBP)mRNA的表達(dá)較其對(duì)照組顯著升高。用藥組大鼠血清和肝組織各項(xiàng)指標(biāo)均明顯改善；肝脂變程度較模型組明顯減輕；肝組織糖類應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ChREBP)mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。 3.12周末，模型組大鼠胰島素抵抗程度較前無(wú)明顯進(jìn)展；和正常組相比，血脂和肝臟脂質(zhì)含量、血清TNF—α含量、轉(zhuǎn)氨酶水平明顯升高；HDL—C含量明顯降低；肝組織出現(xiàn)中到重度脂肪變，肝小葉內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)和散在的點(diǎn)狀壞死，炎

8、癥活動(dòng)度計(jì)分明顯高于正常組(P＜0.01)；肝組織糖類應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ChREBP)mRNA表達(dá)顯著升高，且與前期相比差異顯著(P＜0.01)。用藥組大鼠血清和肝組織各項(xiàng)指標(biāo)均明顯改善；肝組織糖類應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ChREBP)mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.01)；肝組織脂變程度及炎癥活動(dòng)度明顯減輕(P＜0.05，P＜0.01)。 4．相關(guān)性分析顯示：模型組各時(shí)點(diǎn)肝臟糖類應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ChREBP)mRNA水平均與血清TN

9、F—α水平、肝臟炎癥活動(dòng)度計(jì)分呈正相關(guān)(P＜0.01或P＜0.05)。而與ISI僅在8周末模型組呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01)，第12周末二者無(wú)相關(guān)性。 結(jié)論：1．高脂高膽固醇飲食可以成功復(fù)制NAFLD大鼠模型；胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激＼脂質(zhì)過(guò)氧化損傷以及炎癥因子如TNF—α紊亂與NAFLD的發(fā)生密切相關(guān)。 2．正常大鼠肝臟可表達(dá)糖類應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ChREBP)，NAFLD大鼠肝臟糖類應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ChREB