癌性微環(huán)境下NGF對HSCp75NTR表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：本文旨在觀察癌性微環(huán)境下肝星狀細(xì)胞（HSC）神經(jīng)營養(yǎng)素低親合力受體p75（P75ntr）、神經(jīng)營養(yǎng)素高親合力受體酪氨酸激酶A（TrkA）的表達(dá)狀況及神經(jīng)生長因子（NGF）對HSC兩種受體表達(dá)及細(xì)胞生存狀態(tài)的影響，為深入了解肝癌細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的相互作用提供實驗依據(jù)。
　　 方法：⑴MTT法檢測不同時間、不同濃度肝癌細(xì)胞（HepG2）上清液作為條件培養(yǎng)基（取12h、24h、48h的條件培養(yǎng)基分別按1∶8、1∶4、1∶2的比例用

2、無血清DMEM稀釋）對HSC增殖的影響，取促增殖作用最強的一組條件培養(yǎng)基作為實驗用條件培養(yǎng)基。⑵流式細(xì)胞儀（FCM）檢測單純培養(yǎng)HSC、肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理HSC、肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基與不同濃度NGF（1、10、100μg/L）共同作用下HSC的細(xì)胞周期和凋亡率變化。⑶免疫組織化學(xué)（IHC）半定量檢測單純培養(yǎng)HSC、肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理HSC、肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基與不同濃度NGF共同作用下HSC的α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、P75

3、ntr、TrkA的蛋白表達(dá)，用計算機圖像分析系統(tǒng)半定量分析。⑷透射電鏡（TEM）觀察單純培養(yǎng)HSC、肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理HSC、肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基與NGF共同作用下HSC的超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 結(jié)果：①MTT結(jié)果顯示：48h的肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基在1∶2濃度時對HSC的促增殖作用最強。②FCM結(jié)果顯示：與單純培養(yǎng)的HSC相比，肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用的HSC增殖指數(shù)升高，凋亡無明顯變化；肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基與NGF共同作用于HSC后

4、，隨著NGF濃度的增加，細(xì)胞凋亡率增加，但對細(xì)胞增殖無明顯影響。③免疫組化結(jié)果顯示：α-SMA、P75NTR、TrkA在各組的HSC中均有表達(dá)。與單純培養(yǎng)組相比，肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基組的HSC表達(dá)α-SMA、P75NTR、TrkA均有不同程度的增加，在肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基中加入NGF后，HSC表達(dá)α-SMA、P75NTR有隨NGF濃度增加而增加的趨勢，而表達(dá)TrkA有隨NGF濃度增加而減少的趨勢。④透射電鏡結(jié)果顯示：單純培養(yǎng)的HSC細(xì)胞形態(tài)

5、完整，極少見凋亡細(xì)胞。肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用的HSC，可見細(xì)胞增殖活躍，易見核分裂象，凋亡不明顯。在肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基中加入NGF后，HSC凋亡數(shù)目隨NGF濃度的增加而增多，并可見不同時期的凋亡細(xì)胞。
　　 結(jié)論：單純培養(yǎng)的HSC表達(dá)P75ntr和TrkA。HSC經(jīng)肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用后，其P75ntr、TrkA的表達(dá)均增強。但在條件培養(yǎng)基中加入NGF后，HSC的P75ntr表達(dá)增強、TrkA表達(dá)減弱，細(xì)胞凋亡增加。提示在癌性