肺癌和乳腺癌病人DNA修復(fù)能力及關(guān)卡基因蛋白（ATM蛋白）的研究.pdf

1、腫瘤系環(huán)境因素與機體因素(遺傳因素)相互作用的結(jié)果，因此屬于環(huán)境相關(guān)疾病。例如空氣和水污染、吸煙、飲食、職業(yè)接觸和個人生活方式與習(xí)慣等都是與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的環(huán)境因素。同時機體因素在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中也起了十分重要的作用，因此，美國1997年啟動環(huán)境基因組計劃(EnvironmentalGenomicsProject，EGP)，旨在研究環(huán)境相關(guān)疾病中機體應(yīng)答基因作用，包括DNA修復(fù)基因。圖一系腫瘤發(fā)生過程中機體DNA修復(fù)能力所起的作用

2、。 DNA修復(fù)是細(xì)胞保護基因組完整性的重要功能系統(tǒng)之一，機體DNA修復(fù)能力的降低與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。因此，DNA修復(fù)能力，及其對癌癥易感性的影響成為目前環(huán)境腫瘤流行病學(xué)研究的重點。環(huán)境致癌因素誘發(fā)的DNA損傷信號被傳送多個效應(yīng)子。在這個過程中關(guān)卡基因(checkpointgene)(ATM)蛋白起了很重要的作用。ATM(ataxiatelangiectasiamutated)蛋白是一種多功能蛋白激酶，在損傷最早期階段和啟動關(guān)卡

3、信號中起關(guān)鍵作用，它通過磷酸化一系列參與不同細(xì)胞反應(yīng)的下游底物來應(yīng)對DNA損傷。因為肺癌和乳腺癌都是與環(huán)境因素密切相關(guān)的腫瘤，本研究將DNA修復(fù)能力作為研究中心，評價個體的DNA修復(fù)能力，比較腫瘤病人和對照人群的DNA修復(fù)能力差異，分析DNA修復(fù)能力與癌癥易感性的關(guān)聯(lián)；同時觀察肺癌和乳腺癌病人ATM蛋白的表達(dá)水平是否下降，以及與DNA修復(fù)能力的關(guān)系。為肺癌和乳腺癌易感人群研究及預(yù)防提供分子生物學(xué)依據(jù)。本研究分以下幾部分：前期工作：方法學(xué)

4、研究。 (1)用彗星試驗檢測人淋巴細(xì)胞DNA修復(fù)能力的方法學(xué)研究。(UV攻擊試驗) (2)用兩種作用機制不同的攻擊試驗來同時評價癌癥被人的DNA修復(fù)能力。 研究重心：(3)乳腺癌病人DNA修復(fù)能力及ATM蛋白的研究。 (4)肺癌病人DNA修復(fù)能力及ATM蛋白的研究。 第一部分彗星試驗檢測紫外線暴露后人淋巴細(xì)胞DNA修復(fù)能力DNA修復(fù)的途徑有堿基切除修復(fù)(BER)、核苷酸切除修復(fù)(NER)、同源重組

5、修復(fù)(HRR)、非同源末端連接(NHEJ)和錯配修復(fù)(MMR)，其中以NER較為重要。目前測定DNA修復(fù)能力的方法有五類，在進行分子流行病學(xué)調(diào)查時需要一種可靠、靈敏、快速的方法。研究結(jié)果顯示，在單純UVC照射后，11人最大尾長均出現(xiàn)于90min，僅5號最大尾長2.96μm出現(xiàn)于120分鐘，略高于90分鐘的2.93μm。240分鐘尾長明顯低于90分鐘(P＜0.01)，接近照射前水平。照射后90分鐘，UVC+NOV組MTL均值為3.16μm

6、明顯低于UVC組的4.77μm(P＜0.01)，UVC+APC組與UVC組無明顯差異。照射后240分鐘，UVC+APC組MTL均值為3.43μm，明顯高于UVC組的2.43μm(P＜0.01)。UVC+NOV組和UVC+APC組DRRs平均值分別為52.98％、39.57％，明顯低于UVC組的81.84％(P＜0.01)。本研究結(jié)果表明UVC照射后90分鐘，UVC+NOV組MTL明顯低于UVC組，說明DNA鏈切開受到抑制；UVC照射后2

7、40分鐘，UVC+APC組MTL明顯高于UVC組，說明DNA鏈連結(jié)受到抑制。兩組的DRR明顯低于UVC組，說明DRR既能反映切開階段也能反映連接階段受抑制而引起的DNA修復(fù)能力下降。因此通過DNA鏈斷裂的動態(tài)變化，計算DNA修復(fù)率(DRR)，彗星試驗?zāi)苡行У赜糜谠u價DNA修復(fù)能力。 第二部分用UVC攻擊試驗和博來霉素攻擊試驗檢測癌癥病人外周淋巴細(xì)胞DNA修復(fù)能力在本次研究中利用博來霉素及UVC作為誘變劑來評價個體的DNA修復(fù)能力

8、。兩種誘變劑的損傷機理各有不同。UVC誘導(dǎo)產(chǎn)生環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPD)和6-4光產(chǎn)物(6-4PP)，這些DNA損傷主要通過NER修復(fù)。而博來霉素誘導(dǎo)單雙鏈斷裂主要通過HRR，BERandNHEJ修復(fù)。外周血來自33位混合癌癥病人(均未經(jīng)任何放化療)和33個對照(按年齡、性別和吸煙與病人配對)。每個樣本分成兩部分：(1)博來霉素攻擊試驗：淋巴細(xì)胞用20μg·ml-1博來霉素(BLM)暴露30分鐘后修復(fù)15分鐘，再用彗星試驗檢測暴露前后的

9、DNA損傷來評價個體DNA修復(fù)能力。(2)紫外線(UVC)攻擊試驗：淋巴細(xì)胞經(jīng)1.5j·m-2劑量UVC(254nm)照射，用彗星試驗檢測暴露前及暴露后90分鐘、240分鐘的DNA損傷，計算DNA修復(fù)百分比(DRP)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BLM試驗中癌癥病人的DNA修復(fù)率分別為75.63±3.11％和68.98±4.19％(以尾長，尾相作為評價指標(biāo))，明顯低于對照組的91.11±1.09％和88.19±1.71％(P＜0.01)；UVC試驗中癌癥病

10、人的DNA修復(fù)率分別為49.19±3.47％and58.27±3.64％，明顯低于對照組的77.52±2.06％和83.12±2.36％(P＜0.01)。BLM試驗用尾長和尾相計算的DRP(％)之間，及UVC試驗用平均尾長和平均尾相計算的DRP(％)之間存在明顯相關(guān)(P＜0.05)，33例癌癥病人在這兩個試驗中DNA修復(fù)能力均明顯低于對照組，表明DNA修復(fù)能力下降可能是癌癥的易感因素。本研究BLM試驗和UVC試驗的結(jié)果相似，但也有一些差

11、異，少數(shù)病例在兩種試驗中的修復(fù)能力差異明顯，可能系個體對BLM和UVC的易感性不同，或兩種誘變劑誘發(fā)損傷的修復(fù)途徑不同所至。因此，我們建議在分子流行病學(xué)調(diào)查中要用兩種或兩種以上的誘變劑試驗來檢測個體DNA修復(fù)能力，更能客觀反映個體的DNA修復(fù)能力。 第三部分乳腺癌病人外周淋巴細(xì)胞DNA修復(fù)能力與ATM蛋白表達(dá)的研究為了研究乳腺癌病人ATM蛋白表達(dá)與DNA修復(fù)能力是否下降以及兩者的關(guān)系。外周血樣本采自腫瘤科25例乳腺癌病人和25名

12、年齡、性別和吸煙配對的對照組。所有癌癥患者均未經(jīng)任何放化療。一部分細(xì)胞樣本用彗星試驗檢測DNA修復(fù)能力，誘變劑為UVC及BLM。檢測方法同上。剩余細(xì)胞樣本提取胞漿蛋白后用westernblot方法檢測每個研究對象的ATM蛋白表達(dá)量。實驗結(jié)果顯示BLM攻擊試驗中當(dāng)TL作為計算指標(biāo)時，乳癌病人25個癌癥病人中只有5人DNA修復(fù)百分比大于60％。對照組有21人高于60％。癌癥病人平均DNA修復(fù)百分比(40.84％)明顯低于對照組平均DNA修復(fù)

13、百分比(77.09％)(P＜0.01)。TM作為計算指標(biāo)時，其中有7個乳癌病人DNA修復(fù)百分比大于60％，而在對照組中，有21人高于60％。癌癥病人平均DNA修復(fù)百分比(41.33％)也明顯低于對照組平均DNA修復(fù)百分比(77.11％)(P＜0.01)。UVC攻擊試驗中無論是MTL還是MTM作為評價指標(biāo)，對照組的平均DNA修復(fù)百分比明顯高于病人組(P＜0.01)。此外，乳癌病人平均ATM表達(dá)水平為0.585。明顯低于對照組平均ATM表達(dá)

14、水平(1.561)，兩組有明顯差異(P＜0.01)。當(dāng)各項DNA修復(fù)百分比與ATM蛋白表達(dá)量作相關(guān)分析時，發(fā)現(xiàn)ATM蛋白表達(dá)量與BLM攻擊試驗所測的DNA修復(fù)百分比有明顯的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.624(尾長)和0.629(尾相)(P＜0.01)。 第四部分肺癌病人淋巴細(xì)胞DNA修復(fù)能力與ATM蛋白表達(dá)的研究本試驗研究目的：(1)用BLM試驗和UVC試驗來檢測肺癌病人DNA修復(fù)能力是否降低；(2)肺癌病人對兩種誘變劑是否存在修

15、復(fù)的個體差異；(3)肺癌病人ATM蛋白表達(dá)水平是否下降及與DNA修復(fù)能力是否有相關(guān)性。外周血采自36例肺癌病人(均未經(jīng)任何放化療)和36名對照，淋巴細(xì)胞分為三部分。兩部分血分別用UVC試驗和BLM試驗來檢測個體DNA修復(fù)能力。第三部分血分離蛋白并用Westernblot檢測ATM蛋白表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌病人在兩種攻擊試驗中測得的DNA修復(fù)能力都要明顯低于對照組(P＜0.01)。并且部分病人在兩種攻擊試驗中表現(xiàn)出很大的修復(fù)差異。同時，結(jié)果

16、顯示癌癥病人ATM蛋白表達(dá)量明顯低于對照組(P＜0.05)。并且肺癌病人ATM蛋白表達(dá)量與BLM試驗檢測的DNA修復(fù)能力存在很高的相關(guān)性(P＜0.01)。 結(jié)論1.彗星試驗是一種快速，簡便，有效的檢測DNA損傷水平的實驗方法。結(jié)合誘變劑(UV)攻擊試驗，彗星試驗通過檢測DNA鏈斷裂的動態(tài)變化，能有效地來評價DNA修復(fù)能力。 2.DNA修復(fù)能力下降是多種癌癥包括乳腺癌，肺癌的易感因素之一。本課題研究發(fā)現(xiàn)，同一個體在不同的D

17、NA修復(fù)通道上表現(xiàn)出不同的活性。因此，我們建議在分子流行病學(xué)調(diào)查中最好采用兩種或兩種以上的誘變劑試驗來檢測個體DNA修復(fù)能力。以便較客觀地反映個體的'DNA修復(fù)能力。 3.UVC誘導(dǎo)6-4光化學(xué)產(chǎn)物和環(huán)丁烷嘧啶二聚體主要通過NER途徑修復(fù)。BLM是一種擬放射樣化合物，誘導(dǎo)的單雙鏈斷裂主要通過BER，HRR和NHEJ途經(jīng)修復(fù)。而ATM蛋白是處于DNA損傷應(yīng)激網(wǎng)絡(luò)頂端的主要起始信號蛋白之一，DNA雙鏈斷裂引起的染色體結(jié)構(gòu)改變能迅速引