小劑量復(fù)合抗原誘導(dǎo)多病程EAE大鼠長(zhǎng)病程中髓鞘損傷及α-硫辛酸的保護(hù)作用.pdf

1、目的：多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis， MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的脫髓鞘疾病之一，其臨床特征表現(xiàn)為復(fù)發(fā)-緩解交替，并進(jìn)行性加重，但其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，因而，目前還沒(méi)有找到十分有效的治療方法。病理學(xué)研究證實(shí)，多發(fā)性硬化初期就存在髓鞘損傷，但隨著時(shí)間的推移髓鞘反復(fù)損傷而修復(fù)不完全，使得軸索得不到保護(hù)，繼發(fā)性損傷，導(dǎo)致臨床癥狀進(jìn)行性加重。因此，保護(hù)髓鞘、促進(jìn)髓鞘再生是治療多發(fā)性硬化的有效方法。α-硫辛酸作為一種抗氧化劑、

2、免疫調(diào)節(jié)劑，可以減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氧化和免疫損傷，進(jìn)而可能對(duì)髓鞘具有一定的保護(hù)和促進(jìn)再生作用。髓鞘堿性蛋白(Myelin basic protein， MBP)是髓鞘的重要組成部分，對(duì)髓鞘膜狀板層結(jié)構(gòu)的維持有重要作用。當(dāng)髓鞘結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)，MBP從髓鞘上游離，造成髓鞘板層松散或脫失。因此，檢測(cè)腦脊液中MBP的含量變化，可以間接了解中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘程度。由于大鼠的腦脊液含量少且不易獲取，我們采取直接檢測(cè)EAE大鼠的腰膨大組織MBP蛋白的含

3、量變化，來(lái)直接了解長(zhǎng)病程中髓鞘的損傷程度及α-硫辛酸是否對(duì)髓鞘損傷有保護(hù)作用，并通過(guò)檢測(cè)免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子來(lái)探討多發(fā)性硬化的發(fā)病機(jī)制和α-硫辛酸的保護(hù)機(jī)制。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE)是研究多發(fā)性硬化的理想動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)用小劑量豚鼠脊髓勻漿為抗原免疫雌性Wistar大鼠建立EAE模型，發(fā)病后當(dāng)天開(kāi)始給予α-硫辛酸（α-li

4、poic acid， LA）腹腔注射（100mg/kg/d，共7d），并進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)180天的觀察和研究。運(yùn)用神經(jīng)功能評(píng)分、HE染色、三色染色、電鏡、Western Blot等多種方法定性和定量觀察大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘脫失情況來(lái)反映LA的治療效果。同時(shí)，運(yùn)用ELISA檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β， TGF-β)

5、的水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregulatory cells， Treg)即CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的表達(dá)，以對(duì)免疫機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 結(jié)果：
　　 1 自然病程組和LA干預(yù)組大鼠的180d的平均每天積累神經(jīng)功能評(píng)分相比P＜0.01有顯著差異（圖2）。佐劑組無(wú)發(fā)病。因發(fā)病后才給予藥物干預(yù)，故兩組大鼠潛伏期沒(méi)有明顯差別，但復(fù)發(fā)率相比x2=10.797，P=0.001.P＜0.01有顯著差異（表1

6、）。說(shuō)明LA有減輕EAE病情、減少?gòu)?fù)發(fā)的作用。
　　 2 自然病程組與LA干預(yù)組發(fā)病后7d時(shí)HE染色可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)和血管袖套現(xiàn)象(圖4)。
　　 3 三色染色（圖5）和電鏡觀察（圖7）均可見(jiàn)EAE大鼠髓鞘板層松散，電鏡觀察發(fā)病后180d自然病程組髓鞘崩解，有碎片堆積（圖8A）；LA干預(yù)組髓鞘板層損傷較輕，可見(jiàn)再生的薄層髓鞘（圖8B）。佐劑組髓鞘板層致密(圖6)。
　　 4 Western Blot顯示(表2，圖9

7、，圖10)發(fā)病后7d時(shí)三組MBP蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差別；與同期佐劑對(duì)照組比較自然病程組發(fā)病后180d時(shí)MBP表達(dá)下降，t=6.800,P=0.002,P＜0.01，有明顯差異；硫辛酸干預(yù)組發(fā)病后180d時(shí)MBP表達(dá)與同期佐劑對(duì)照組比較也下降t=3.389，P=0.028,P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。自然病程組發(fā)病后180d時(shí)與硫辛酸干預(yù)組同期相比MBP表達(dá)更低，t=4.035,P=0.016,P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明LA對(duì)髓鞘有遠(yuǎn)期

8、的保護(hù)作用。
　　 5 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示(表3、4、5，圖11、12、13)：無(wú)論自然病程組還是LA治療組的大鼠血清中TNF-α的表達(dá)量在發(fā)病后7d和14d都高于佐劑對(duì)照組，P＜0.01，有顯著差異；LA治療組7d和14d與同期自然病程組比較均下調(diào)，發(fā)病后7d(P＜0.01)、發(fā)病后14d(P＜0.05)，說(shuō)明LA對(duì)TNF-α有下調(diào)作用。TGF-β的表達(dá)量無(wú)論自然病程組還是LA治療組的發(fā)病后7d和14d都低于佐劑對(duì)照組，分

9、別為P＜0.01和P＜0.05:LA治療組7d和14d與同期自然病程組比都上調(diào)，發(fā)病后7d(P＜0.01)、發(fā)病后14d(P＜0.05)，說(shuō)明LA對(duì)TGF-β有上調(diào)作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)全血中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量與TGF-β水平的變化趨勢(shì)一致。自然病程組和LA治療組大鼠于發(fā)病后14d較發(fā)病后7d時(shí)TNF-α有不同程度的降低，TGF-β和CD4+CD25+Foxp3+T有不同程度的上升。說(shuō)明三因子與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。