三種動物回腸總菌及乳酸菌對家兔隱窩和小鼠DCs炎性反應(yīng)的影響.pdf

1、家兔腸道易受感染，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥和隨后高的死亡率。腸道中的細(xì)菌包括各種共生菌代謝產(chǎn)物和菌體成分可以誘導(dǎo)腸道炎癥反應(yīng)。研究證實(shí)革蘭氏陰性菌菌體比陽性菌菌體更容易引起炎癥。與豬和雞等單胃動物不同，采食后的家兔各腸段的主要菌門是革蘭氏陰性菌擬桿菌，且革蘭氏陽性菌乳酸菌在總菌中所占比例很低。本論文比較健康成年豬、雞和家兔回腸總菌對培養(yǎng)的家兔隱窩細(xì)胞及DC炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)作用，并研究本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)篩選的幾株兔源乳酸菌對腸道上皮中隱窩細(xì)胞和樹突狀細(xì)

2、胞的炎性調(diào)節(jié)作用，以探討家兔特有的腸道菌群是否會導(dǎo)致其腸道更易發(fā)生炎癥，以及乳酸菌是否可緩解炎性反應(yīng)，且不同乳酸菌的緩解作用是否存在差異，兩種不同細(xì)胞類型對抗原的炎性反應(yīng)的差異，為家兔篩選益生菌，提高仔兔免疫力和減少仔兔腸炎發(fā)生提供理論依據(jù)。主要的研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.試驗(yàn)一：從未飼喂抗菌素的健康6月齡關(guān)中黑豬、42日齡科寶肉雞和60日齡成年獺兔回腸中收集內(nèi)容物，每種動物3個個體的回腸內(nèi)容物等量混樣提取菌群基因組DNA，I

3、llumina HiSeq測序?qū)Ρ确治鲐i、雞和家兔回腸總菌組成。結(jié)果顯示，家兔回腸菌群第一優(yōu)勢菌門是擬桿菌門，占總菌群的百分比為89.32％;豬和雞回腸菌群最優(yōu)菌門是厚壁菌門，分別占80.79％和88.50％。三種動物回腸內(nèi)容物中乳桿菌屬豐度分別為19.19％、81.19％和0.72％。Beta多樣性指數(shù)顯示豬和雞回腸菌群組成接近，家兔與兩者差異較大。
　　2.試驗(yàn)二：(1)對試驗(yàn)一中豬、雞及家兔回腸總菌滅活后作用于培養(yǎng)的家兔隱窩

4、細(xì)胞，空白對照組添加PBS，熱滅活總菌處理隱窩6h后收集細(xì)胞，測定相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果如下:與對照組相比，豬和雞回腸滅活總菌顯著提高家兔隱窩細(xì)胞的TLR2、TLR3和TLR4拘表達(dá)（P＜0.05）;家兔回腸總菌能顯著提高TLR4的表達(dá)(P＜0.01)。各處理組對TLR9均無顯著影響(P＞0.05)。三種總菌均顯著提高了促炎性因子TNF-α和IL-6的表達(dá)(P＜0.05)。雞回腸總菌對抗炎性因子IL-10的表達(dá)刺激作用比其他組顯著(P＜0

5、.05)，且豬和雞回腸總菌提高了IFN-β的表達(dá)(P＜0.05），豬回腸總菌比家兔回腸總菌有增加IL-10表達(dá)的趨勢（P＜0.1），但家兔回腸總菌對抗炎因子IL-10的表達(dá)沒有促進(jìn)作用(P＞0.05)，甚至有降低IFN-β表達(dá)的趨勢（P＜0.1）。(2)用實(shí)驗(yàn)室前期分離的兔源植物乳桿菌L.p2、干酪乳桿菌L.a1和屎腸球菌E.f2，以及購買的大腸桿菌E.coli K88滅活后對仔兔隱窩細(xì)胞進(jìn)行刺激6h后收集細(xì)胞，測定相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果

6、如下:三株乳酸菌顯著提高了TLR2、TLR3和IFN-β的表達(dá)(P＜0.05)。大腸桿菌E.coli K88顯著提高了TLR4表達(dá)(P＜0.05)。植物乳酸菌L.p2、屎腸球菌E.f2和大腸桿菌E.coli K88組均顯著提高隱窩細(xì)胞TNF-α的表達(dá)(P＜0.05)。各處理均顯著提高了IL-6的表達(dá)(P＜0..05)。植物乳桿菌L.p2和屎腸球菌E.f2顯著提高了IL-10的表達(dá)（P＜0.05），E.coli K88組IL10的表達(dá)顯著

7、低于對照組(P＜0.05)。三株乳酸菌中植物乳桿菌對促炎性因子的刺激作用更強(qiáng)。
　　3.試驗(yàn)三：用豬、雞和家兔回腸總菌及兔源乳酸菌的滅活菌刺激小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞系DC2.4細(xì)胞，結(jié)果表明:(1)DC2.4細(xì)胞受到滅活L.p2刺激后，TLR2、TLR4、TNF-α和IL-10表達(dá)隨著刺激時間增加呈現(xiàn)先升高后降低的規(guī)律，在2h前后表達(dá)量較高。(2)豬、雞和家兔回腸總菌刺激DC2.4細(xì)胞2h后，豬和雞回腸菌比家兔回腸菌顯著提高TLR3

8、表達(dá)(P＜0.05)。豬和雞回腸菌顯著提高了TLR2和TLR4的表達(dá)(P＜0.05)，家兔回腸菌有提高TLR2的趨勢（P＜0.1），但對TLR3無顯著影響(P＞0.05)。各處理組對TLR9表達(dá)無顯著影響（P＞0.05），均顯著提高了TNF-α及IL-10的表達(dá)(P＜0.05），但家兔回腸總菌對TNF-α表達(dá)刺激作用顯著高于豬和雞回腸總菌。雞回腸總菌顯著提高了IL-6和IFN-β的表達(dá)(P＜0.05)，豬回腸總菌有提高IL-6和IFN-

9、β基因表達(dá)的趨勢(P＜0.1)，但是家兔回腸總菌對IFN-β的表達(dá)無明顯的影響(P＞0.05)和有提高IL-6基因表達(dá)的趨勢（P＜0.1）。(3)在乳酸菌刺激DC2.4細(xì)胞2h的試驗(yàn)中，與對照組相比，L.p2、L.a1和E.f2顯著提高TLR2的表達(dá)(P＜0.05)。L.a1和E.f2顯著提高了TLR3的表達(dá)(P＜0.05)。E.coli K88顯著提高了TLR4和TNF-α的表達(dá)(P＜0.05)。L.p2和E.f2顯著提高了TNF-α

10、基因的表達(dá)(P＜0.05)。相比對照組，L.a1和E.f2有增加IFNβ的趨勢(P＜0.1)。E.f2和E.coli K88顯著提高了IL-1基因表達(dá)(P＜0.05)。
　　綜上所述，家兔回腸菌群第一優(yōu)勢菌門是擬桿菌門，豬和雞第一優(yōu)勢菌門為厚壁菌門，且家兔回腸乳酸菌遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于豬和雞;與豬和雞回腸總菌相比，家兔回腸總菌更容易使隱窩和DC2.4細(xì)胞處于炎癥狀態(tài);滅活乳酸菌能夠引起細(xì)胞免疫反應(yīng)中抗炎性和促炎性因子的同步表達(dá)，有利于維持機(jī)體