鉑類聯(lián)合抗嘧啶類藥物序貫療法在宮頸癌治療中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、化學(xué)治療已經(jīng)成為宮頸癌的綜合治療的方法之一。Meta分析[1]結(jié)果表明：與手術(shù)后放療比，化療后再手術(shù)治療是宮頸癌有效的治療模式，5年生存率提高7％~14％?？灌奏ゎ愃幬锸歉鞣N進(jìn)展期癌癥治療中的重要化療藥物[2]。國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2003年推薦宮頸癌使用順鉑(75mg/m2)加氟尿嘧啶(4000mg/m2，靜脈滴注>96h)為宮頸癌患者的化療方案。美國(guó)國(guó)家癌癥研究所推薦此方案為宮頸鱗癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。該方案中順鉑的毒副作用限制了

2、它的應(yīng)用，5-FU也存在生物利用度低、應(yīng)用不方便等缺點(diǎn)。有必要尋找新的療效確實(shí)、毒副反應(yīng)較小、用藥方便的化療藥物和化療方案。 卡鉑作為第二代鉑類藥物，劑量限制性的毒副作用顯著減少，可以根據(jù)患者腎功能個(gè)體化用藥，卡培他濱是口服的5-FU前體藥物，具有選擇性的細(xì)胞毒作用，能夠模擬持續(xù)輸注5-FU的作用。胸苷磷酸化酶(thymidinephosphorylase，TP)不僅是卡培他濱選擇性發(fā)揮細(xì)胞毒作用的關(guān)鍵酶，還能催化5-FU向其活

3、性代謝產(chǎn)物氟尿嘧啶脫氧核苷酸轉(zhuǎn)化，提高患者對(duì)抗嘧啶類藥物的敏感性。應(yīng)用抗嘧啶類藥物時(shí)，胸苷磷酸化酶(thymidinephosphorylase，TP)高的患者術(shù)后平均生存時(shí)間長(zhǎng)。TP的表達(dá)可決定腫瘤對(duì)抗嘧啶類藥物的化療敏感性，是卡培他濱(capecitabine，CAP)化療的預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)記物[3]。 本課題組已有研究表明卡鉑與DFUR(卡培他濱的水化制劑)聯(lián)合的細(xì)胞抑制作用比順鉑與DFUR聯(lián)合強(qiáng)，但均弱于順鉑聯(lián)合5-FU。順鉑

4、和卡鉑對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞株的TP表達(dá)均有上調(diào)作用，但是SiHa細(xì)胞在鉑類藥物作用后TP上調(diào)怎樣變化?TP升高后再加用抗嘧啶類藥物，是否會(huì)取得更好的化療效果?可否利用TP的變化尋找更好療效的序貫化療方案?這些問題值得進(jìn)一步探討。 本研究通過體外培養(yǎng)宮頸癌SiHa細(xì)胞株，研究順鉑、卡鉑上調(diào)TP的變化情況、比較二者的異同：并利用這個(gè)變化研究聯(lián)合5-FU、OFUR序貫化療方案對(duì)宮頸癌細(xì)胞株抑制作用的影響，期望尋找療效確切、用藥方便、毒

5、性較低的宮頸癌輔助化療方案。 研究方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 SiHa細(xì)胞株應(yīng)用RPMI1640培養(yǎng)基，置于含5％CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組、順鉑組、卡鉑組共3組。根據(jù)本課題組已有結(jié)論選擇藥物作用72小時(shí)的IC50，順鉑和卡鉑分別是：19uM，236.82uM；DMSO的濃度控制在0.5％。 2.RT-PCR檢測(cè)順鉑和卡鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞株TPmRNA表達(dá)的影響 各組細(xì)胞

6、分別于藥物作用后0，4，8，12，16，24，36，48小時(shí)檢測(cè)TPmRNA表達(dá)。 3.Westernblot檢測(cè)順鉑和卡鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞株TP蛋白表達(dá)的影響 各組細(xì)胞分別于藥物作用后0，6，12，18，24，30小時(shí)檢測(cè)TP蛋白表達(dá)。 4.MTT法檢測(cè)順鉑和卡鉑上調(diào)TP后5-Fu、DFUR序貫用藥細(xì)胞的增殖抑制情況 分9組：空白對(duì)照組，順鉑+5-FU對(duì)照組(DF組，同時(shí)加藥組)、順鉑+5-FU實(shí)驗(yàn)組(DF

7、’組，先加順鉑，TP峰值時(shí)加5-FU，即序貫方案組)，卡鉑+5-Fu對(duì)照組(CF組)、卡鉑+5-FU實(shí)驗(yàn)組(CF’組)，順鉑+DFUR對(duì)照組(DD組)、順鉑+DFUR實(shí)驗(yàn)組(DD’組)，卡鉑+DFUR對(duì)照組(CD組)、卡鉑+DFUR實(shí)驗(yàn)組(CD’組)。 順鉑、卡鉑均選用藥物作用72小時(shí)的IC50，5-FU，DFUR參考臨床最大峰值血藥濃度各選取八個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度。 以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，24h后，除空白對(duì)照

8、組外，其他對(duì)照組同時(shí)加入鉑類和抗嘧啶類藥物(根據(jù)上述分組加5-Fu或者DFUR八個(gè)遞減濃度組)，實(shí)驗(yàn)組只加入相應(yīng)鉑類藥物，培養(yǎng)24小時(shí)后，全部棄舊培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入含相應(yīng)遞減濃度的抗嘧啶類藥物，余組別加入不含藥物之新鮮培養(yǎng)基，再次培養(yǎng)24小時(shí)之后，MTT法在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD595。 5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物對(duì)宮頸癌細(xì)胞株凋亡的影響(FITC/PI雙標(biāo)記試劑盒) 分9組，同4。藥物濃度選擇：5-FU、DFUR、順鉑、卡鉑均選

9、用藥物作用72小時(shí)的IC50。DMSO濃度控制在0.5％。用6孔板，接種24h后，除空白對(duì)照組外，其他對(duì)照組同時(shí)加入鉑類和抗嘧啶類藥物，實(shí)驗(yàn)組只加入相應(yīng)鉑類藥物，培養(yǎng)24小時(shí)后，全部棄舊培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入含相應(yīng)抗嘧啶類藥物，余組別加入不含藥物之新鮮培養(yǎng)基，再次培養(yǎng)24小時(shí)之后收集細(xì)胞按FITC/PI雙標(biāo)記試劑盒說明檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果： 1.順鉑和卡鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞株TPmRNA及蛋白表達(dá)的影響順鉑和卡鉑作用4～8小

10、時(shí)后TPmRNA表達(dá)開始增加，24小時(shí)達(dá)高值，相對(duì)于空白組，順鉑組升高2.52倍，卡鉑組升高1.90倍，24小時(shí)后漸降低，順鉑和卡鉑作用6～12小時(shí)后TP蛋白增加，24小時(shí)達(dá)高峰，順鉑組和卡鉑組表達(dá)分別是對(duì)照組的3.45倍和2.73倍。蛋白質(zhì)增加幅度大于mRNA，順鉑組與卡鉑組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.5-FU、DFUR在與順鉑、卡鉑聯(lián)合用藥時(shí)序貫化療對(duì)宮頸癌細(xì)胞株細(xì)胞增殖抑制的影響在TP升高后抗嘧啶類藥物作用24小時(shí)MTT檢測(cè)

11、結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組全部增殖明顯，所有實(shí)驗(yàn)組的IC50全部較對(duì)照組升高，相比于聯(lián)合5-FU的組別，聯(lián)合DFUR組別的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差別較小。 3.5-FU、DFUR在與順鉑、卡鉑聯(lián)合用藥時(shí)序貫化療對(duì)宮頸癌細(xì)胞株凋亡的影響實(shí)驗(yàn)組凋亡率均較相應(yīng)對(duì)照組要高，方差分析僅卡鉑+OFUR實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的；4個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間比較，聯(lián)合DFUR的組別凋亡率絕對(duì)值均高，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；聯(lián)合DFUR的實(shí)驗(yàn)組凋亡率高于傳統(tǒng)化療方案對(duì)應(yīng)的