3-甲基腺嘌呤對(duì)細(xì)胞自噬的雙重調(diào)節(jié)作用及NBA1調(diào)控放射誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯的初步研究.pdf

1、自噬是指細(xì)胞將一些異常聚集或錯(cuò)誤折疊蛋白、損傷的細(xì)胞器等胞漿成分通過包裹并最終運(yùn)送至溶酶體降解的過程，其主要功能之一是在營養(yǎng)缺乏、生長(zhǎng)因子撤除、能量匱乏或受到應(yīng)激性的死亡威脅時(shí)，使細(xì)胞獲得對(duì)抗不利的生長(zhǎng)環(huán)境、維持穩(wěn)態(tài)、實(shí)現(xiàn)更新的一種重要的自我保護(hù)性反應(yīng)機(jī)制。但當(dāng)細(xì)胞受到嚴(yán)重的不可修復(fù)的損傷，如大劑量的電離輻射輻照、某些化療藥物的作用，自噬就會(huì)轉(zhuǎn)變成為細(xì)胞的一種死亡機(jī)制。正是由于自噬在決定細(xì)胞命運(yùn)中的雙重作用，有關(guān)其調(diào)控機(jī)制的研究受到極大

2、關(guān)注。目前，激活或者抑制自噬的實(shí)驗(yàn)方法有自噬基因敲除、沉默、過表達(dá)及藥物處理。人類乳腺癌抑癌基因1（BRCA1）被證明與許多信號(hào)路徑和細(xì)胞進(jìn)程有關(guān)，研究顯示，BRCA1敲低可增強(qiáng)細(xì)胞自噬，因此被認(rèn)為是一種自噬抑制劑。NBA1是2009年新確認(rèn)的BRCA1相互作用蛋白，同時(shí)也是BRCA1 A復(fù)合體成員的新組分，其敲低可導(dǎo)致BRCA1 A復(fù)合體的不穩(wěn)定。
　　本課題在研究PI3K抑制劑3-MA對(duì)電離輻射及非電離輻射后細(xì)胞存活影響的基礎(chǔ)

3、上，采用3-MA和電離輻射作用于不同輻射敏感性的HeLa細(xì)胞，觀察自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，利用類轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）技術(shù)構(gòu)建用于NBA1敲除的打靶質(zhì)粒對(duì)，同時(shí)利用小干擾RNA等構(gòu)建了NBA1穩(wěn)定敲低及過表達(dá)細(xì)胞模型，觀察NBA1敲低后細(xì)胞表型和DNA損傷反應(yīng)變化。目前獲得了以下主要進(jìn)展：
　　1.3-MA能促進(jìn)電離輻射誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡，抑制輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，同時(shí)促進(jìn)正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬；對(duì)電離輻射敏感的DNA-PKc

4、s敲低HeLa，其受4Gy照射誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬明顯增強(qiáng)；與分割(2Gy×2)照射相比，單劑量（4Gy）照射引起的細(xì)胞自噬活性更強(qiáng)。
　　2.成功構(gòu)建能特異性識(shí)別并結(jié)合NBA1目標(biāo)序列的TALEN質(zhì)粒三對(duì)（T12、T34和T56），SSA法鑒定顯示T56具有更高的切割效率，進(jìn)一步酶切鑒定顯示T56可以用于NBA1基因的敲除。
　　3. Western blotting和qRT-PCR結(jié)果顯示NBA1穩(wěn)定敲低和過表達(dá)的MCF-7細(xì)