3-甲基腺嘌呤及SIK2對(duì)放射誘發(fā)細(xì)胞自噬的影響研究.pdf

1、目的：研究PI3K抑制劑3-MA、SIK2以及分割照射對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞自噬的影響，探索SIK2在電離輻射誘發(fā)細(xì)胞自噬中的作用。探討3-MA在細(xì)胞照射后對(duì)細(xì)胞自噬及凋亡發(fā)生的影響，并觀察照射的生物效應(yīng)時(shí)效規(guī)律，為闡明電離輻射誘發(fā)細(xì)胞自噬的機(jī)制提供新的依據(jù)。
　　方法：
　　1.4 Gy60Coγ、3-MA早期作用（即在照射后即刻時(shí)間點(diǎn)加入3-MA并作用12 h）和3-MA后期作用（即在照射后12 h加入3-MA并作

2、用12 h）于shRNA介導(dǎo)SIK2敲低的Hela-shSIK2及其對(duì)照細(xì)胞后，于0 h，12 h，24 h，48 h和72 h用 CCK8檢測(cè)不同處理后細(xì)胞的增殖和毒性效應(yīng)。
　　2.4Gy60Coγ、3-MA早期作用和3-MA后期作用于Hela-shSIK2及其對(duì)照細(xì)胞，AnnexinV-FITC/PI標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　3.2Gy、4 h分割照射劑量(2+2Gy)和單劑量4Gy X射線照射以及3-MA早期

3、作用于Hela-shSIK2及其對(duì)照細(xì)胞，克隆形成率檢測(cè)細(xì)胞的放射敏感性。
　　4.2Gy、4 h分割照射劑量(2+2Gy)和單劑量4Gy X射線照射后，免疫印跡檢測(cè)LC3蛋白隨照射后時(shí)間表達(dá)水平的變化。
　　5.2Gy、4 h分割照射劑量(2+2Gy)和單劑量4Gy X射線照射轉(zhuǎn)染 GFP-LC3質(zhì)粒的Hela-shSIK2及其對(duì)照細(xì)胞，免疫熒光觀察自噬體的形成。
　　結(jié)果：
　　1. CCK8結(jié)果顯示各處理組

4、和對(duì)照組相比，在12 h內(nèi)3-MA晚期作用組無(wú)明顯影響，其余處理組在12 h時(shí)即發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，P<0.05；以4Gy照射組為對(duì)照組，照射聯(lián)合3-MA早期（照射后即刻至12 h）處理組在12h，24h，48h，72h產(chǎn)生更大的毒性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01；以4 Gy照射組為對(duì)照組，照射聯(lián)合3-MA后期（照射后12 h至24 h）處理組在24h、48h和72h產(chǎn)生更大的毒性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。
　　2.

5、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)凋亡發(fā)現(xiàn)以0 h為對(duì)照組，各處理組的凋亡率增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01；以4Gy照射組為對(duì)照，照射聯(lián)合3-MA早期作用組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。以照射聯(lián)合3-MA早期作用組為對(duì)照，3-MA后期作用組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。
　　3.克隆形成率實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3-MA聯(lián)合2+2 Gy照射組與3-MA聯(lián)合4 Gy照射組相比較，細(xì)胞存活率高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；各劑量組加入3-MA前期作用后存

6、活率明顯降低，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。Hela-shSIK2細(xì)胞3-MA聯(lián)合照射組與對(duì)照組Hela-shNC細(xì)胞對(duì)放射更加敏感，細(xì)胞存活率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。
　　4.Western Blot結(jié)果表明，在對(duì)照細(xì)胞中三種劑量下都能引起LC3II的增多，并在24 h達(dá)到高峰。不同劑量同一時(shí)間LC3II表達(dá)情況，分割照射2+2Gy LC3II的表達(dá)水平比單次4Gy照射高，說(shuō)明分割照射似乎增強(qiáng)了輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬；

7、而在敲低細(xì)胞中，LC3II的表達(dá)水平比對(duì)照細(xì)胞低，說(shuō)明SIK2敲低細(xì)胞減弱了細(xì)胞自噬。
　　5.免疫熒光可看出SIK2敲低的細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白LC3的熒光強(qiáng)度不及對(duì)照組。更有效的證實(shí)了SIK2對(duì)電離輻射后細(xì)胞自吞噬的負(fù)調(diào)控。且分割照射劑量2+2 Gy的熒光強(qiáng)度比其他照射組同一時(shí)間的熒光強(qiáng)度強(qiáng)。
　　結(jié)論：3-MA早期作用和3-MA晚期作用對(duì)細(xì)胞毒性存在差異，3-MA早期作用對(duì)細(xì)胞毒性更大。3-MA早期作用比3-MA晚期作用更能