Midkine新亞型和相應(yīng)RNA新剪切形式的發(fā)現(xiàn)：它在小鼠胚胎發(fā)育與腫瘤生成過程中表達(dá)與功能初探.pdf

1、Midkine(MK)是一類肝素結(jié)合生長/分化因子，是小鼠胚胎發(fā)育中視黃酸誘導(dǎo)的早期表達(dá)基因之一。迄今研究表明，MK具有較廣泛的生物學(xué)功能，如它參與了生長、分化、血管生成和細(xì)胞凋亡等過程。它不僅與胚胎發(fā)育有關(guān)，與癌變、腫瘤生成也密切相關(guān)。 為了研究MK在組織分化和器官生成中的表達(dá)情況和潛在的功能，(一)我們首先通過免疫組化方法研究MK在空間上的表達(dá)行為。結(jié)果我們首次發(fā)現(xiàn)，在組織器官(胰臟和腎臟等)的發(fā)育分化過程中，(1)MK主要

2、富集于上皮(epithelial)—間充質(zhì)(mesenchymal)界面處；(2)尤其是在接近新生血管的界面處；(3)而且，MK的表達(dá)隨細(xì)胞的分化/成熟度的增加而降低；并且，它的表達(dá)在未分化上皮干細(xì)胞的基膜處維持最高，而隨著細(xì)胞的分化和成熟而降低。這些揭示了它在組織器官發(fā)育分化過程中普遍存在的上皮—間充質(zhì)相互作用，在最近發(fā)現(xiàn)的新生血管對組織分化的誘導(dǎo)作用的信號傳導(dǎo)，以及對調(diào)節(jié)干細(xì)胞的自我更新/增殖與分化的平衡等方面都發(fā)揮一定的作用。

3、 (二)然后，我們用RT-PCR的方法檢測MK在時間上的表達(dá)行為。為了提高PCR反應(yīng)的靈敏度和專一性，我們采用了巢式(Nested)、直降(Touchdown)PCR的方法。結(jié)果，(1)我們不僅發(fā)現(xiàn)MK的表達(dá)隨胚胎發(fā)育而受調(diào)制，即在E6.5至E15.5期間有明顯表達(dá)，而在此區(qū)間前后，則表達(dá)甚微；(2)我們還首次檢測到，MK的截短型(truncated，tMK)在正常胚胎發(fā)育過程中的某些器官(如胰臟和肝臟)發(fā)育的特定階段(如E11.5

4、至E12.5)有明顯表達(dá)。在此之前，tMK一般只在腫瘤和癌癥組織中被檢測到，并一直被普遍認(rèn)為，tMK參與誘變癌癥/腫瘤，而作為檢測癌癥/腫瘤的一種標(biāo)志。因此，我們的發(fā)現(xiàn)，為研究MK在腫瘤生成和癌變中的機理，提供了新視野；(3)隨后，用同樣的技術(shù)，我們又發(fā)現(xiàn)了在小鼠正常器官發(fā)育的特定階段(如E11.5至E12.5的胰臟和肝臟)，MK的另外兩種新截短型，分別稱tMK-B和tMK-C。它們在E8.5和E14.5及其前后均沒有表達(dá)。這表明它們在

5、器官形成中具有某種獨特的功能；(4)分析表明，這三種截短型，首次在小鼠中檢測到；(5)并且，雖然tMK-C相應(yīng)的截短型(缺失一個完整的外顯子)在人體病變組織中的表達(dá)已有報道，但tMK-A和tMK-B則是全新的截短型；(6)有趣的是，它們(tMK-A，tMK-B和tMK-C)的剪切位點序列具有特異性，3'和5'端剪切位點堿基序列相同，即tMK-A的3'和5'端剪切位點序列為-AGTG-、tMK-B為-GACC-、tMK-C則為-AGCC-

6、。這是首次發(fā)現(xiàn)具有序列專一性的mRNA剪切模式。從基因結(jié)構(gòu)上看，tMK-A、tMK-B缺失了外顯子Ⅲ和Ⅳ的部分，tMK-C缺失了外顯子Ⅳ?？梢?，這里很可能存在著一種新的mRNA剪接加工的分子機制?？偨Y(jié)這方面的表達(dá)研究，我們不僅驗證了MK在正常胚胎發(fā)育中的調(diào)控表達(dá)，而且首次發(fā)現(xiàn)了截短型MK在正常發(fā)育中的特異表達(dá)。這些對揭示MK在發(fā)育分化中的功能和分子機理，提供了新思路。綜合實驗室研究，在人類癌變組織中MK表達(dá)的新發(fā)現(xiàn)(MK也存在三種截短型

7、)，這些研究將有利于認(rèn)清MK在腫瘤生成和癌變過程中的作用和潛在分子機制(如可能是由于新的剪切方式的突變而造成癌變等)。 (三)為了進一步探究MK功能的分子機理，我們克隆了MK及其截短型，并通過表達(dá)載體PET28a在BL21菌中表達(dá)，以研究MK及各種截短型的分子活性。初始結(jié)果表明，MK及其截短型，對成纖維腫瘤細(xì)胞的遷移(migration)，形態(tài)發(fā)生和增殖有一定作用。這些結(jié)果為進一步更廣泛(如其它細(xì)胞系、條件等)、更深入(分子機理