硫化氫對(duì)哇巴因誘發(fā)的豚鼠乳頭肌遲后去極化及觸發(fā)活動(dòng)的影響.pdf

1、目的：硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是繼一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化碳( carbon monoxide，CO)之后的第三種新型氣體信號(hào)分子。人們發(fā)現(xiàn)H2S不但可以在體內(nèi)內(nèi)源性的生成，而且還發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。內(nèi)源性H2S是由L-半胱氨酸在磷酸吡哚醛-5’-磷酸依賴性酶，即胱硫醚-β-合成酶（cystathionie-β-sythase，CBS）和胱硫醚-Y-裂解酶(cystathionin

2、e-γ-lyase，CSE)，半胱氨酸轉(zhuǎn)移酶等催化作用下產(chǎn)生的。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性H2S在體內(nèi)多個(gè)部位都可以檢測(cè)到。在心血管系統(tǒng)內(nèi)源性H2S主要是通過CSE催化產(chǎn)生，H2S通過興奮血管平滑肌細(xì)胞上的ATP敏感性鉀離子通道（ATP sensitive K+，KATP通道），促進(jìn)K+外流同時(shí)抑制Ca2+內(nèi)流，從而達(dá)到舒張血管平滑肌的作用。KATP通道也廣泛分布在心肌組織上，其開放具有重要的內(nèi)源性心臟保護(hù)機(jī)制?，F(xiàn)有的研究報(bào)告表明

3、H2S可以濃度依賴性地縮短離體豚鼠乳頭肌的動(dòng)作電位時(shí)程，對(duì)部分去極化乳頭狀肌，除了能夠縮短動(dòng)作電位時(shí)程之外，還可降低動(dòng)作電位幅值和超射值，減慢零相最大上升速度，其機(jī)制可能通過興奮KATP通道促進(jìn)K+外流，同時(shí)抑制Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而影響豚鼠乳頭狀肌電生理效應(yīng)。它對(duì)于調(diào)節(jié)整個(gè)心血管系統(tǒng)功能和結(jié)構(gòu)具有普遍性作用。然而目前對(duì)疾病種類的研究還比較有限，對(duì)于H2S在其他一些心血管疾病例如心律失常等方面的作用及作用機(jī)制的研究也較少。
　　 由

4、遲后去極化（delayed afterdepolarization，DAD）所引發(fā)的觸發(fā)活動(dòng)（triggerd activity，TA）是心律失常特別是惡性心律失常的重要發(fā)病機(jī)制之一，現(xiàn)已證實(shí)誘發(fā)遲后去極化的關(guān)鍵因素是細(xì)胞內(nèi)鈣超載。因?yàn)镠2S有抑制Ca2+內(nèi)流的效應(yīng)，因此推測(cè)H2S可通過興奮KATP通道和抑制Ca2+內(nèi)流從而減輕細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載進(jìn)而抑制遲后去極化及觸發(fā)活動(dòng)，并推測(cè)H2S有抗心律失常的作用。本研究用含哇巴因( Ouaba

5、in)的高鈣K-H液灌流離體豚鼠乳頭肌以誘發(fā)遲后去極化（DAD）及觸發(fā)活動(dòng)(TA)，以NaHS作為H2S的供體，旨在通過應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)微電極技術(shù)觀察H2S對(duì)哇巴因誘發(fā)的豚鼠乳頭肌遲后去極化及觸發(fā)活動(dòng)的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法：健康雄性豚鼠，體重300～400克/只，豚鼠擊昏后迅速打開胸腔，取出心臟，置于95％O2和5％CO2混合氣體氧飽和的冷(0～4℃)K-H液中，輕輕擠出積血，沿前室間溝右緣剪開右心室，選擇分支少

6、、大小約0.6mm×lmm×3mm的柱狀乳頭肌，用線結(jié)扎腱索端，剪下乳頭肌，用不銹鋼針固定于標(biāo)本槽底部的硅膠上。用35.5士0.5℃的K-H液（pH7.38土0.03）恒溫恒速灌流，流速4ml/min。由刺激器提供刺激頻率為2Hz，波寬為lms，強(qiáng)度為1.5倍閾刺激的方波信號(hào)，用雙極起搏電極以場(chǎng)刺激驅(qū)動(dòng)標(biāo)本，產(chǎn)生動(dòng)作電位。應(yīng)用含哇巴因（1lrmol/L）和高鈣(5.5mmol/L)的氧飽和K-H液灌流，誘發(fā)穩(wěn)定且可重復(fù)的遲后除極（DAD

7、）和觸發(fā)活動(dòng)(TA)。用細(xì)胞內(nèi)玻璃微電極技術(shù)記錄DAD和TA諸參數(shù)，包括DAD的潛伏期、幅值、時(shí)程，TA的發(fā)生率。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為5組，每組6只，各組處理方案如下：
　　 1 哇巴因誘發(fā)的DAD和TA組：共用六只豚鼠，標(biāo)本在正常的K-H液平衡1小時(shí)后，記錄正常動(dòng)作電位，用含哇巴因（1μmol/L）和CaCl2(5.5mmol/L)的K-H液灌流，在豚鼠乳頭肌誘發(fā)DAD和TA，并觀察此時(shí)DAD和TA的特性，記錄各參數(shù)，包括DAD潛伏期

8、、幅值和時(shí)程，TA的發(fā)生率。
　　 2 H2S對(duì)哇巴因誘發(fā)的DAD和TA效應(yīng)組：共用六只豚鼠，標(biāo)本在正常的K-H液平衡1小時(shí)，記錄正常動(dòng)作電位，用含哇巴因（1μmol/L）和CaCl2(5.5mmol/L)的K-H液灌流，在豚鼠乳頭肌誘發(fā)DAD和TA，記錄各參數(shù)，用K-H液沖洗至DAD和TA消失，AP恢復(fù)到正常水平；然后標(biāo)本預(yù)先用含NaHS50μmol/L的K-H液灌流10min，在此基礎(chǔ)上再加入哇巴因lμmol/L和CaCl2

9、5.5mmol/L灌流標(biāo)本，分別記錄觀察DAD和TA各參數(shù)的變化，然后用K-H液沖洗并觀察AP的恢復(fù)。用同樣的方法記錄NaHS(100μmol/L、200μmol/L)時(shí)DAD和TA各參數(shù)的變化。
　　 3 KATP通道阻斷劑格列本脲(Glibenclamide，Gli)對(duì)H2S的效應(yīng)組：共用六只豚鼠，標(biāo)本在正常的K-H液中平衡1小時(shí)，記錄正常動(dòng)作電位，用含哇巴因（1μmol/L）和CaCl2(5.5mmol/L)的K-H液誘導(dǎo)

10、DAD和TA，并觀察記錄各參數(shù)；用K-H液沖洗至到DAD和TA消失，AP恢復(fù)到正常水平，觀察NaHS（100μmol/L）對(duì)哇巴因誘發(fā)的DAD和TA的影響，方法同2，記錄DAD和TA各參數(shù)，用K-H液沖洗并觀察AP的恢復(fù)；用含格列苯脲20μmol/L的K-H液灌流10min，之后再加入NaHSl00μmol/L灌流10min，再加入哇巴因lμmol/L、CaCl25.5mmol/L灌流標(biāo)本，記錄DAD和TA各參數(shù)。
　　 4 L

11、型鈣通道開放劑BayK8644(0.25μmol/L)對(duì)H2S的效應(yīng)組：觀察哇巴因誘發(fā)的DAD和TA各參數(shù)，記錄對(duì)照；觀察NaHSl00μmol/L對(duì)DAD和TA各參數(shù)的影響，記錄對(duì)照；預(yù)先用含BayK8644（0.25μmol/L）的K-H液灌流10min，之后再加入NaHSl00μmol/L灌流10min，再加入哇巴因1μmol/L、CaCl25.5mmol/L灌流標(biāo)本，記錄DAD和TA各參數(shù)。
　　 5 NO合酶抑制劑L-

12、NAME(1mmol/L)對(duì)H2S的效應(yīng)組：觀察哇巴因誘發(fā)的DAD和TA各參數(shù)，記錄對(duì)照；觀察NaHS100μmol/L對(duì)DAD和TA各參數(shù)的影響，記錄對(duì)照；預(yù)先用含L-NAME（1mmol/L）的K-H液灌流10min，之后再加入NaHS100μmol/L灌流10min，再加入哇巴因1μmol/L、CaCl25.5mmol/L灌流標(biāo)本，記錄DAD和TA各參數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)預(yù)先給予NaHS（50、100、

13、200μmol/L），可劑量依賴性地抑制哇巴因所誘發(fā)的豚鼠心室乳頭肌遲后去極化(DAD)及觸發(fā)活動(dòng)(TA)。NaHS（50、100、200μmol/L）可以延長(zhǎng)DAD的潛伏期（由對(duì)照組的12.03±1.01min分別延長(zhǎng)至14.68士1.11min、19.93士1.56min、23.68士1.25min），降低DAD的幅度(由對(duì)照組的11.47±0.74mV降至9.08±1.58mV、6.47士0.33mV、5.65士0.26mV)，縮

14、短DAD的時(shí)程（由對(duì)照組的205.18士11.09ms分別降至184.87士5.27ms、172.55±9.82ms、134.45士6.59ms），同時(shí)還可降低TA的發(fā)生率(由對(duì)照組的83％分別降至66％、33％、17％)。
　　 (2)預(yù)先應(yīng)用KATP阻斷劑格列本脲Gli（20μmol/L）可部分阻斷H2S的上述效應(yīng)；
　　 (3)預(yù)先應(yīng)用L型鈣通道開放劑BayK8644（0.25μmol/L），可完全阻斷H2S的上述