賈第蟲賈第素蛋白多克隆抗體的制備及免疫熒光定位研究.pdf

1、賈第蟲病(giardiasis)自上世紀(jì)70年代末已被世界衛(wèi)生組織列為人獸共患寄生蟲病。十二指腸賈第蟲（Giardia duodenalis）是通過糞-口途徑傳播并在脊椎動物中引起腹瀉的重要寄生蟲，能夠廣泛感染人、家畜及野生動物。此外，賈第蟲還可感染魚、兩棲動物、爬行動物、鳥類和嚙齒動物。賈第蟲感染人常引起腹瀉，同時伴有胃腸脹氣、腹痛、腸病變、體重減輕和吸收不良綜合征等癥狀，兒童、免疫缺陷或受損的人最易感。對于家畜，賈第蟲可導(dǎo)致其發(fā)病從

2、而造成相應(yīng)的經(jīng)濟(jì)損失。賈第蟲也是旅行者腹瀉常見的病原。因此，賈第蟲病被視為重要的人獸共患寄生蟲病。
　　預(yù)防賈第蟲病的關(guān)鍵是建立靈敏特異的診斷方法，對病原快速有效的鑒定對于研究和了解賈第蟲的流行病學(xué)至關(guān)重要。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，賈第蟲細(xì)胞骨架蛋白和毒力之間存在較強(qiáng)的生物學(xué)聯(lián)系。因為賈第蟲必須借助其細(xì)胞骨架在腸內(nèi)移行并附著于腸黏膜上以避免被清除。賈第蟲是高度分化的原生動物，細(xì)胞骨架主要包括四對鞭毛、腹吸盤和中體等結(jié)構(gòu)。賈第素是賈第蟲特有的、

3、含量豐富的細(xì)胞骨架蛋白，其已被劃分為α-賈第素(α-giardin)，β-賈第素(β-giardin)，δ-賈第素（δ-giardin）和γ-賈第素（γ-giardin），大小在29-38 kDa。α-giardins是一類鈣依賴性膜結(jié)合蛋白，包含21個成員的多基因家族。α-giardins的多樣性揭示了賈第蟲生物學(xué)功能的重要性。目前，國內(nèi)外對α-giardins的研究較多，但對δ-giardin和γ-giardin的研究相對較少。

4、r>　　因此，本研究根據(jù)GenBank中公布的δ-giardin和γ-giardin序列設(shè)計引物，從賈第蟲集聚體A中提取了總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板擴(kuò)增了δ-giardin和γ-giardin目的基因，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-δ-giardin和pET-28a-γ-giardin，將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Rosseta(DE3)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行重組蛋白的原核表達(dá)。再經(jīng)過KCl染色切膠純化法獲得較純的融合

5、蛋白，以不同濃度梯度的尿素作為變性劑，溶解包涵體進(jìn)行透析復(fù)性。隨后，針對重組蛋白制備了多克隆抗體，并且利用免疫熒光定位技術(shù)分析賈第素在蟲體中的分布情況。結(jié)果表明，δ-giardin基因全長882 bp，編碼293個氨基酸;γ-giardin基因全長936bp，編碼311個氨基酸，重組蛋白相對分子量分別約為36 kDa和38 kDa，重組蛋白均以包涵體的形式存在。然而，試驗過程中，δ-giardin表達(dá)量較低，純化后的濃度不適于免疫動物。