藍(lán)氏賈第蟲賈第素α-13及延伸因子EF-1α的原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位.pdf

1、藍(lán)氏賈第蟲是一種重要的人獸共患寄生性原蟲，寄生于人和多種哺乳動物的小腸，常引起以腹瀉、腹痛和消化不良等為主的賈第蟲病。賈第蟲滋養(yǎng)體具有高度發(fā)達(dá)的細(xì)胞骨架系統(tǒng)（微管、微絲和骨架蛋白），在入侵宿主過程中能夠釋放一些分泌性蛋白，兩者均與其致病機(jī)理密切相關(guān)。本文以人獸共患的藍(lán)氏賈第蟲A型為研究對象，分別擴(kuò)增賈第素α-13和延伸因子 EF-1α的編碼基因并進(jìn)行原核表達(dá)，利用 Ni-NTA Resin層析柱對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，分別制備多克隆抗體對賈

2、第素α-13及EF-1α進(jìn)行滋養(yǎng)體的亞細(xì)胞定位，以便為探索賈第素α-13及EF-1α的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　1.賈第素α-13的原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位。根據(jù) GenBank中賈第素α-13基因序列設(shè)計(jì)引物，以賈第蟲DNA基因組為模板，擴(kuò)增賈第素α-13基因。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-g-α13并轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。采用IPTG誘導(dǎo)和復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基（ZYM-5052）對目的蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)

3、SDS-PAGE和Western blot分析鑒定并經(jīng)Ni-NTA Resin層析柱純化，純化產(chǎn)物與免疫佐劑乳化后免疫昆明鼠制備多克隆抗體。通過Western blot篩選特異性抗血清，采用間接免疫熒光法對賈第素α-13進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，賈第素α-13基因全長為1038 bp，編碼345個氨基酸，融合蛋白Mr約為40 kDa，主要以可溶性形式存在。試驗(yàn)獲得了大量高純度的融合蛋白。制備的多克隆抗體具有良好的抗原結(jié)合力及特異性，間接

4、免疫熒光顯示賈第素α-13主要位于滋養(yǎng)體的鞭毛和細(xì)胞膜。
　　2.延伸因子EF-1α的原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位。根據(jù) GenBank中EF-1α基因序列設(shè)計(jì)引物，以賈第蟲 DNA為模板，擴(kuò)增 EF-1α基因。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-EF-1α并轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。采用IPTG對目的蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析鑒定，并采用Ni-NTA Resin層析柱純化。經(jīng)生物

5、信息學(xué)分析后合成 EF-1α抗原肽，與匙孔血藍(lán)蛋白（KLH）偶聯(lián)后免疫新西蘭白兔制備多克隆抗體，采用Protein A Resin親和層析純化抗體，通過Western blot驗(yàn)證抗體結(jié)合力，最后采用間接免疫熒光法對EF-1α進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，EF-1α基因全長為1329 bp，編碼442個氨基酸，融合蛋白Mr約為50 kDa，試驗(yàn)獲得了較純凈的融合蛋白；抗體 AFL1192具有良好的抗原結(jié)合力與特異性，間接免疫熒光顯示EF-1