IVF刺激周期注射hCG日及注射hCG次日血清高孕酮濃度對著床期內(nèi)膜影響的研究.pdf

1、第一部分 IVF刺激周期中注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮濃度對胚胎著床率的影響
　　目的:
　　已知注射hCG日孕酮濃度對IVF胚胎著床率有預(yù)測價(jià)值，然而，注射hCG次日的血清孕酮濃度對IVF胚胎著床率是否也有預(yù)測價(jià)值呢？與注射hCG日孕酮濃度相比，其預(yù)測價(jià)值相對較低？相同？或更高？
　　方法:
　　本研究為單中心、回顧性、觀察性隊(duì)列研究。研究對象為自2011年1月～2013年5月間于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸

2、夫醫(yī)院生殖中心接受IVF治療的全部5828個(gè)卵巢刺激周期的臨床資料。研究期間，本中心的鮮胚移植策略:僅患者獲卵數(shù)≦15枚，注射hCG日孕酮≦2.0 ng/ml，且無卵巢過度刺激(ovarian hyperstimulationsyndrome，OHSS)傾向等條件均同時(shí)滿足的前提下，方可進(jìn)行新鮮胚胎移植。否則，建議患者全部新鮮胚胎冷凍，擇期行凍融胚胎移植。
　　研究期間，所有患者均于注射hCG日及注射hCG次日清晨采取血樣檢測血清

3、雌二醇濃度和孕酮濃度。研究期間均使用同樣的血清性激素檢測試劑盒，無臨床或胚胎實(shí)驗(yàn)室治療方案變動(dòng)。研究期間本中心的胚胎著床率和臨床妊娠率均維持在穩(wěn)定水平。
　　為研究注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮濃度與胚胎著床率之間的關(guān)系，全部1457個(gè)IVF新鮮胚胎移植周期納入進(jìn)一步研究。
　　以胚胎著床率為因變量，通過多因素逐步回歸分析的方法，分析下列因素:年齡，獲卵數(shù)，注射hCG日子宮內(nèi)膜厚度，注射hCG日雌二醇水平，注射hCG日

4、孕酮水平，注射hCG次日雌二醇水平，注射hCG次日孕酮水平，注射hCG日孕酮與注射hCG次日孕酮之和，總rFSH用量，總rFSH刺激天數(shù)，移植胚胎數(shù)，移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)，與胚胎著床率之間的關(guān)系。
　　根據(jù)2011年-2013年間本中心的5828個(gè)IVF刺激周期注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮濃度數(shù)據(jù)，將孕酮濃度“升高”定義為孕酮值高于整體孕酮值分布的90％百分位數(shù)，未能達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)則定義為孕酮濃度“正常”。
　　進(jìn)一步將這14

5、57個(gè)新鮮胚胎移植周期根據(jù)注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮濃度正?；蛏叻譃?組:NN組，注射hCG日及注射hCG次日孕酮濃度均正常;NH組，注射hCG日孕酮濃度正常但注射hCG次日孕酮濃度升高;HN組，注射hCG日孕酮濃度升高但注射hCG次日孕酮濃度正常;HH組，注射hCG日及注射hCG次日孕酮濃度均升高，進(jìn)行臨床各指標(biāo)及胚胎著床率和臨床妊娠率的組間比較。
　　結(jié)果:
　　1.根據(jù)5828個(gè)IVF刺激周期注射hCG日及

6、注射hCG次日血清孕酮濃度數(shù)據(jù)，注射hCG日孕酮平均水平為1.4±0.8 ng/ml，注射hCG次日孕酮水平顯著增加7.9±5.5 ng/ml(P＜0.001)。
　　2.注射hCG后12小時(shí)，血清孕酮濃度較注射hCG之前的孕酮濃度相比，上升＞5倍。
　　3.根據(jù)5828個(gè)IVF刺激周期注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮濃度數(shù)據(jù)，注射hCG日孕酮正?；蛏叩腸ut-off值為1.7 ng/ml;注射hCG次日孕酮正常或升高

7、的cut-off值為9.5 ng/ml。
　　4.多因素逐步回歸分析結(jié)果顯示，年齡、獲卵數(shù)、注射hCG日孕酮和注射hCG次日孕酮之和為3個(gè)顯著影響胚胎著床率的因素。若將注射hCG日孕酮和注射hCG次日孕酮之和從自變量列表中剔除，則注射hCG次日孕酮被回歸方程選擇為第三個(gè)顯著影響胚胎著床率的因素;若進(jìn)一步將注射hCG次日孕酮也從自變量列表中剔除，則注射hCG日孕酮被回歸方程選擇為第三個(gè)顯著影響胚胎著床率的因素。
　　5.145

8、7個(gè)新鮮胚胎移植周期根據(jù)注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮濃度正?；蛏叻譃?組后比較發(fā)現(xiàn):與NN組相比，HH組患者顯著更年輕（31.9±4.6歲&29.7±3.5歲，P＜0.001），基礎(chǔ)FSH更低(8.1±1.9IU/L&7.9±1.2IU/L，P＜0.05)，獲卵數(shù)更多（7.9±4.0個(gè)&12.7±3.3個(gè)，P＜0.001），胚胎數(shù)更多（5.3±3.0個(gè)&6.7±2.6個(gè)，P＜0.001），移植胚胎數(shù)/移植周期無顯著差別（1.8

9、±0.4個(gè)&1.8±0.4個(gè)），移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/移植周期差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.6±0.5個(gè)&1.7±0.5個(gè)），但胚胎著床率卻顯著低下(36.0％&22.2％，P＜0.001)，臨床妊娠率也顯著低下(59.7％&37.5％，P＜0.001)。
　　結(jié)論:
　　臨床工作中決定是否進(jìn)行全部胚胎冷凍時(shí)，不應(yīng)僅關(guān)注注射hCG日血清孕酮濃度，還應(yīng)結(jié)合考慮注射hCG次日的血清孕酮濃度。
　　第二部分 IVF刺激周期中注射hCG日及

10、注射hCG次日血清孕酮濃度對著床期內(nèi)膜形態(tài)學(xué)和uNK細(xì)胞數(shù)目的影響
　　目的:
　　IVF刺激周期中注射hCG日及注射hCG次日的高血清孕酮濃度，是否影響著床期子宮內(nèi)膜的形態(tài)變化？以及uNK細(xì)胞的數(shù)目？
　　方法:
　　本研究為單中心，前瞻性隊(duì)列研究。研究對象選自2013年7月～2013年12月間于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院生殖中心接受IVF治療的119名患者。
　　研究期間，本中心的鮮胚移植策略:僅患者

11、獲卵數(shù)≦15枚，注射hCG日孕酮≦2.0 ng/ml，且無卵巢過度刺激(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)傾向等條件均同時(shí)滿足的前提下，方可進(jìn)行新鮮胚胎移植。否則，建議患者考慮全部新鮮胚胎冷凍，擇期行凍融胚胎移植。119名患者均按照本中心已建立的新鮮胚胎移植策略選擇進(jìn)行全部胚胎冷凍。取卵術(shù)后按本中心常規(guī)黃體支持方案給予肌注黃體酮，于注射hCG+7天通過一次性官腔組織吸引管取少量內(nèi)膜組織行形態(tài)學(xué)

12、分析和uNK細(xì)胞數(shù)目檢測。
　　內(nèi)膜組織學(xué)評分由兩位有經(jīng)驗(yàn)的觀察者依據(jù)Noyes等(1950)建立的標(biāo)準(zhǔn)按照盲法獨(dú)立完成;uNK細(xì)胞計(jì)數(shù)由兩位觀察者獨(dú)立完成。均進(jìn)行觀察者間差異評估。
　　119名患者均于注射hCG日及注射hCG次日的清晨采取血樣檢測血清雌二醇濃度和孕酮濃度。
　　分別通過多因素逐步回歸的方法分析下列因素:注射hCG日孕酮濃度，注射hCG次日孕酮濃度，注射hCG日雌二醇濃度，注射hCG次日雌二醇濃度，r

13、FSH刺激時(shí)間，與內(nèi)膜組織學(xué)評分結(jié)果和uNK細(xì)胞數(shù)目的關(guān)系。
　　根據(jù)2011年-2013年間本中心的5828個(gè)IVF刺激周期注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮濃度數(shù)據(jù)，將孕酮濃度“升高”定義為孕酮值高于整體孕酮值分布的90％百分位數(shù)，未能達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)則定義為孕酮濃度“正常”。由此，注射hCG日孕酮正?；蛏叩腸ut-off值為1.7 ng/ml;注射hCG次日孕酮正?；蛏叩腸ut-off值為9.5 ng/ml。進(jìn)一步進(jìn)行了內(nèi)膜

14、組織學(xué)評分結(jié)果、腺體-基質(zhì)發(fā)育不同步比例和uNK細(xì)胞數(shù)目在孕酮正常組和孕酮升高組的組間比較。
　　結(jié)果:
　　（注射hCG日和注射hCG次日血清高孕酮濃度與內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化之間的關(guān)系）
　　1.多因素逐步回歸分析結(jié)果顯示:注射hCG次日血清孕酮濃度為唯一顯著影響內(nèi)膜組織學(xué)評分結(jié)果的因素。
　　2.將119例樣本根據(jù)注射hCG次日血清孕酮濃度正常或升高(cut-off值:9.5ng/ml)分為兩組:觀察者1結(jié)果:與孕

15、酮正常組（7.6±0.7天）相比，孕酮升高組的內(nèi)膜發(fā)育更為成熟（8.0±0.6天），差異顯著(P＜0.001);觀察者2結(jié)果:與孕酮正常組（6.8±1.0天）相比，孕酮升高組的內(nèi)膜發(fā)育更為成熟（7.6±0.8天），差異顯著(P＜0.001)。
　　3.兩位觀察者所提供的組織學(xué)評分結(jié)果具有很顯著的相關(guān)性(r=0.394，P＜0.001)。整體來講，70％的結(jié)果差異于1天之內(nèi)，95％的結(jié)果差異于2天之內(nèi)。
　　4.孕酮正常組中腺

16、體-基質(zhì)發(fā)育不同步（腺體-基質(zhì)成熟天數(shù)相差≧4天）的樣本比例約為～51％，顯著(P＜0.001)高于孕酮升高組中腺體-基質(zhì)發(fā)育不同步所占的樣本比例22％。
　?。ㄗ⑸鋒CG日和注射hCG次日血清高孕酮濃度與內(nèi)膜uNK細(xì)胞數(shù)目之間的關(guān)系）
　　5.多因素逐步回歸分析結(jié)果顯示:注射hCG日血清孕酮濃度為唯一顯著影響內(nèi)膜uNK細(xì)胞數(shù)目的因素。
　　6.兩位觀察者uNK計(jì)數(shù)的結(jié)果顯著相關(guān)(r=0.9，P＜0.05)，uNK細(xì)胞

17、計(jì)數(shù)的平均差異值為2.4％（±3.3％）。
　　7.將119例樣本根據(jù)注射hCG日血清孕酮濃度正?；蛏?cut-off值:1.7ng/ml)分為兩組:孕酮升高者內(nèi)膜的uNK細(xì)胞數(shù)目9.2％(1.3-21.6％)（中位數(shù)（范圍））顯著(P＜0.001)高于孕酮正常者的內(nèi)膜uNK細(xì)胞數(shù)目6.3％(1.4-18.7％)。
　　結(jié)論:
　　IVF刺激周期中注射hCG日及注射hCG次日血清高孕酮促使著床期內(nèi)膜發(fā)育更為成熟，uN

18、K細(xì)胞數(shù)目顯著增加。
　　第三部分 IVF刺激周期中注射hCG日及注射hCG次日血清孕酮濃度對著床期內(nèi)膜基因表達(dá)譜的影響
　　目的:
　　研究IVF刺激周期中注射hCG日及注射hCG次日血清高孕酮對著床期內(nèi)膜基因表達(dá)譜的影響，本部分研究尤其關(guān)注的問題是，參與uNK細(xì)胞生成及功能調(diào)節(jié)的相關(guān)基因的表達(dá)，在多大程度上受到了高孕酮濃度的影響？
　　方法:
　　本研究為單中心，前瞻性隊(duì)列研究。研究對象選自2013年7

19、月～2013年12月間于本生殖中心接受IVF治療的12名患者。
　　這12名患者均按照本中心已建立的鮮胚移植策略進(jìn)行全部胚胎冷凍。取卵后按照本中心常規(guī)黃體支持方案肌注黃體酮，于注射hCG+7天通過一次性官腔組織吸引管取少量內(nèi)膜組織行基因芯片實(shí)驗(yàn)和組織形態(tài)學(xué)分析。
　　12名患者均于注射hCG日及注射hCG次日的清晨采取血樣檢測血清雌二醇濃度和孕酮濃度。根據(jù)2011年-2013年間本中心的5828個(gè)IVF刺激周期注射hCG日及

20、注射hCG次日血清孕酮濃度數(shù)據(jù)，將孕酮濃度“升高”定義為孕酮值高于整體孕酮值分布的90％百分位數(shù)，未能達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)則定義為孕酮濃度“正?！薄Ｓ纱?，注射hCG日孕酮正常或升高的cut-off值為1.7ng/ml;注射hCG次日孕酮正?；蛏叩腸ut-off值為9.5 ng/ml。
　　根據(jù)注射hCG日孕酮濃度和注射hCG次日孕酮濃度正常或升高，12名患者可分為4組:組1(NN)，注射hCG日和注射hCG次日孕酮均正常;組2(NH)，注

21、射hCG日孕酮正常但注射hCG次日孕酮升高;組3(HN)，注射hCG日孕酮升高但注射hCG次日孕酮正常;組4(HH)，注射hCG日和注射hCG次日孕酮均升高。
　　組間比較表達(dá)差異≧2倍，且P＜0.05被選擇為顯著差異表達(dá)基因。
　　分別依次進(jìn)行組間顯著差異表達(dá)基因的比較:組4(HH)與組1(NN)比較，組3(HN)與組1(NN)比較，以及組2(NH)與組1(NN)比較。分別將各組間比較所獲得的顯著差異表達(dá)基因列表向DAVI

22、D（基因功能分析網(wǎng)站）提交，通過DAVID提供的KEGG pathway功能進(jìn)行差異表達(dá)基因的相關(guān)功能分析。
　　根據(jù)組4(HH)與組1(NN)比較獲得的153個(gè)顯著差異表達(dá)基因，對12個(gè)樣本進(jìn)行聚類分析。
　　選擇8個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCT驗(yàn)證。這8個(gè)基因中，4個(gè)基因選自NK細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒作用通路中表達(dá)異常的基因，包括CD247分子(Cd247)，殺傷細(xì)胞瘦素樣受體超家族C，成員2(KLRC2),殺傷細(xì)胞瘦素樣受體超家族D

23、，成員1(KLRD1),自然細(xì)胞毒作用觸發(fā)受體1(NCR1)，另4個(gè)基因包括:水通道蛋白-3(AQP3)，富含亮氨酸重復(fù)因子1(LRRC1)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP26)，和鈣結(jié)合蛋白S100P。
　　結(jié)果:
　　1.4組患者年齡、基礎(chǔ)內(nèi)分泌、注射hCG日雌二醇水平、注射hCG次日雌二醇水平、rFSH刺激時(shí)間、獲卵數(shù)等各臨床指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.組4(HH)與組1(NN)比較共153個(gè)基因表達(dá)差異顯著，DA

24、VID KEGGpathway分析結(jié)果顯示4條pathway受到顯著影響，按照受影響程度從大到小依次排序?yàn)?NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(15個(gè)基因表達(dá)失調(diào))，抗原表達(dá)和提呈（6個(gè)基因表達(dá)失調(diào)），移植物宿主相關(guān)疾?。?個(gè)基因表達(dá)失調(diào)），和淀粉和糖代謝（6個(gè)基因表達(dá)失調(diào)）。
　　3.組3（HN）與組1(NN)的pathway分析結(jié)果顯示3條pathway受到顯著影響，按照受影響程度從大到小依次排序?yàn)?細(xì)胞周期（8個(gè)基因表達(dá)失調(diào)），剪接體

25、（7個(gè)基因表達(dá)失調(diào)），NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（7個(gè)基因表達(dá)失調(diào)）。
　　4.組2(NH)與組1(NN)的pathway分析結(jié)果顯示5條pathway受到顯著影響，根據(jù)受影響程度從大到小依次為:細(xì)胞周期（7個(gè)基因表達(dá)失調(diào)），剪接體(7個(gè)基因表達(dá)失調(diào)），NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（7個(gè)基因表達(dá)失調(diào)），wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（7個(gè)基因表達(dá)失調(diào)），和抗原表達(dá)和提呈（5個(gè)基因表達(dá)失調(diào)）。
　　5.注射hCG日和注射hCG次日兩天內(nèi)，只要有

26、一天的孕酮濃度升高，NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用通路均受到顯著影響;若兩天的孕酮濃度均升高，NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用通路成為受影響最為顯著的一條pathway(P＜0.0001)。
　　6.組4(HH)與組1(NN)比較時(shí)，15個(gè)NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用pathway中表達(dá)差異顯著的基因分別為:殺傷細(xì)胞瘦素樣受體超家族C，成員2（KLRC2，上調(diào)3.2倍）;殺傷細(xì)胞瘦素樣受體超家族C，成員3（Klrc3，上調(diào)2.2倍）;殺傷細(xì)胞瘦素樣

27、受體超家族D，成員1（KLRD1，上調(diào)3.4倍）;殺傷細(xì)胞瘦素樣受體超家族K，成員1（KLRK1，上調(diào)2.4倍）;自然細(xì)胞毒觸發(fā)受體1（Ncr1，上調(diào)3.1倍）;顆粒酶B（GZMB，上調(diào)2.4倍）;血細(xì)脆生成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子（HCST，上調(diào)2.5倍）;Fc fragment of IgG,低親合力Ⅲa，受本(CD16a)（Fcgr3a，上調(diào)2.3倍）;CD247分子（Cd247，上調(diào)2.3倍）;Fc fragment of IgE,高親合力

28、Ⅰ，gamma多肽受體（FCER1G，上調(diào)2.8倍）;TYRO酪氨酸激酶結(jié)合蛋白（TYROBP，上調(diào)2.6倍）;穿孔素1（Prfl，上調(diào)2.4倍）;ras-相關(guān)C3肉毒桿菌毒素底物2(rho家族，小GTP結(jié)合蛋白R(shí)ac2)（rac2，上調(diào)2.3倍）;殺傷細(xì)胞瘦素樣受體超家族C，成員1（Klrc1，上調(diào)3.2倍）;腫瘤壞死因子（配體）超家族，成員10（TNFSF10，下調(diào)2.4倍）。
　　7.根據(jù)組4（HH）與組1(NN)比較得到的

29、153個(gè)差異表達(dá)基因，對12個(gè)樣本的聚類結(jié)果顯示，4組患者的基因表達(dá)譜各不相同，其中，組2(NH)和組3(HN)的基因表達(dá)譜相對較為相似。
　　8.CD247,KLRC2,KLRD1,NCR1,AQP3,LRRC1,MMP26,S100P的qPT-PCR驗(yàn)證結(jié)果均與芯片結(jié)果一致。
　　結(jié)論:
　　1.注射hCG日孕酮濃度和注射hCG次日孕酮濃度均可影響著床期內(nèi)膜基因表達(dá)譜的改變。
　　2.IVF刺激周期注射hCG