STAT5-TET2調(diào)控單核細(xì)胞FCER1G基因啟動(dòng)子DNA甲基化的分子機(jī)制及其在特應(yīng)性皮炎發(fā)病中的作用.pdf

1、特應(yīng)性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是一種常見的慢性瘙癢性皮膚病，在全球成人發(fā)病率1-3％，而嬰幼兒發(fā)病率高達(dá)10-20％，而且在過去30年中工業(yè)化國(guó)家發(fā)病率增加了2-3倍;目前它已成為日益嚴(yán)重的公眾健康問題[1-2]。但是，目前特應(yīng)性皮炎的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，現(xiàn)在認(rèn)為遺傳易感性、環(huán)境因素以及免疫因素相互作用導(dǎo)致特應(yīng)性皮炎的發(fā)病，表觀遺傳作為介導(dǎo)環(huán)境與遺傳相互作用的重要機(jī)制，為研究遺傳與環(huán)境因素如何誘發(fā)AD等過敏性

2、疾病發(fā)病提供了全新的思路和途徑，表觀遺傳調(diào)控主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和microRNA等[3]。我們研究發(fā)現(xiàn)AD患者CD14+單核細(xì)胞存在基因組整體DNA低甲基化，并發(fā)現(xiàn)AD患者單核細(xì)胞FCER1G基因啟動(dòng)子序列低甲基化促使Fc受體γ亞基（FcRγ）及其相關(guān)的IgE高親和力受體(FcεR1)和C型凝集素受體（Dectin-2）異常表達(dá)[4]。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)前炎癥因子GM-CSF，TSLP等活化STAT5通路募集DNA去甲基化酶TE

3、T2共同結(jié)合至單核細(xì)胞FCER1G基因啟動(dòng)子序列，引起該啟動(dòng)子DNA序列去甲基化，激活FCER1G基因轉(zhuǎn)錄，使Fc受體γ亞基（FcRγ）及其相關(guān)的IgE高親和力受體(FcεR1)和C型凝集素受體（Dectin-2）表達(dá)增加，GM-CSF預(yù)處理的體外誘導(dǎo)的單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞(MoDC)異常表達(dá)Dectin-2并明顯增強(qiáng)對(duì)過敏原卵清蛋白(OVA)提呈及誘導(dǎo)Th2分化。
　　因此，我們提出:前炎癥因子GM-CSF，TSLP等→活化

4、STAT5通路→募集DNA去甲基化酶TET2→引起單核細(xì)胞FCER1G基因啟動(dòng)子DNA序列去甲基化→單核細(xì)胞Fc受體γ亞基（FcRγ）及其表面IgE高親和力受體(FcεR1)和C型凝集素受體（Dectin-2）表達(dá)增加→促進(jìn)TH2細(xì)胞分化，誘導(dǎo)過敏反應(yīng)→特應(yīng)性皮炎發(fā)病。這一假定的發(fā)病機(jī)制首先通過分析AD患者單核細(xì)胞整體基因組甲基化狀態(tài)及FCER1G基因啟動(dòng)子DNA序列甲基化狀態(tài)，F(xiàn)c受體γ亞基（FcRγ）及其表面IgE高親和力受體(Fc

5、εR1)和C型凝集素受體(Dectin-2)表達(dá)，體外補(bǔ)丁甲基化驗(yàn)證DNA甲基化調(diào)控FCER1G基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性;前炎癥因子GM-CSF，IL-3，TSLP激活STAT5通路對(duì)CD14+單核細(xì)胞FCER1G基因啟動(dòng)子DNA序列甲基化狀態(tài)，F(xiàn)c受體γ亞基(FcRγ)及其表面IgE高親和力受體(FcεR1)和C型凝集素受體(Dectin-2)表達(dá)的影響;用免疫共沉淀(IP)及染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)驗(yàn)證磷酸化STAT5募集DNA去甲基

6、化酶TET2并共同結(jié)合至單核細(xì)胞FCER1G基因啟動(dòng)子序列，引起該啟動(dòng)子DNA序列去甲基化;體外誘導(dǎo)異常表達(dá)Dectin-2的單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞對(duì)自身CD4+T細(xì)胞活化及Th分化的影響。通過這些研究揭示了前炎癥因子GM-CSF，TSLP激活STAT5/TET2通路對(duì)單核細(xì)胞FCER1G基因啟動(dòng)子DNA甲基化調(diào)控及其在特應(yīng)性皮炎發(fā)病中的作用與分子機(jī)制，為AD的防治提供全新的表觀遺傳學(xué)干預(yù)途徑。
　　第一章AD患者單核細(xì)胞FCE

7、R1G啟動(dòng)子調(diào)控序列甲基化狀態(tài)及其與FcRγ表達(dá)相關(guān)性分析
　　目的:AD患者單核細(xì)胞FCER1G啟動(dòng)子調(diào)控序列甲基化狀態(tài)及其與FcRγ及其相關(guān)受體Dectin-2表達(dá)相關(guān)性分析。
　　方法:用磁珠分選法分離10例AD患者及正常對(duì)照CD14+單核細(xì)胞，提取基因組DNA，用MethylampTM整體DNA甲基化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)AD與正常對(duì)照單核細(xì)胞基因組DNA整體甲基化水平，用亞硫酸鹽測(cè)序法檢測(cè)AD與正常對(duì)照單核細(xì)胞FCER1G

8、啟動(dòng)子調(diào)控序列甲基化狀態(tài)，用real-time RT-PCR和western-blot檢測(cè)FcRγ表達(dá)水平，并分析兩者相關(guān)性，同時(shí)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD14+單核細(xì)胞FcRγ相關(guān)受體Dectin-2表達(dá)。
　　結(jié)果:1.AD組單核細(xì)胞基因組DNA整體甲基化較正常對(duì)照組明顯下降（36.74±10％ vs55.85±20.32％，P=0.019）;AD組單核細(xì)胞FCER1G調(diào)控序列DNA甲基化水平較正常對(duì)照組明顯降低(34.0％±

9、5.0％ vs46.3％±7.9％, P=0.001);
　　2.AD組單核細(xì)胞FcRγmRNA及蛋白水平較正常對(duì)照組明顯升高(P=0.01，P＜0.001)，F(xiàn)cR蛋白表達(dá)水平與FCER1G調(diào)控序列DNA甲基化水平呈明顯負(fù)相關(guān)性(R=-0.772，P＜0.001);
　　3.AD組外周血單核細(xì)胞Dectin-2表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.001)。
　　結(jié)論:AD組單核細(xì)胞FCER1G調(diào)控序列存在病理性DNA低

10、甲基化，導(dǎo)致FcRγ及相關(guān)受體Dectin-2過度表達(dá)。
　　第二章補(bǔ)丁甲基化技術(shù)構(gòu)建特殊報(bào)告載體檢測(cè)DNA甲基化對(duì)FCER1G基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控
　　目的:構(gòu)建一種特殊的熒光素報(bào)告載體檢測(cè)DNA甲基化對(duì)FCER1G基因啟動(dòng)子調(diào)控序列轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控。
　　方法:用補(bǔ)丁甲基化技術(shù)構(gòu)建特殊的含完全甲基化和未甲基化的FCER1G啟動(dòng)子調(diào)控序列的PGL-3熒光素報(bào)告載體;通過比較完全甲基化與未甲基化熒光素報(bào)告載體活性來檢

11、測(cè)DNA甲基化對(duì)FCERG基因啟動(dòng)子調(diào)控序列的調(diào)控活性。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建特殊的完全甲基化與未甲基化FCER1G啟動(dòng)子調(diào)控序列熒光素報(bào)告載體;并檢測(cè)出甲基化與未甲基化熒光素報(bào)告載體活性比為0.36±0.07:1，P＜0.001。
　　結(jié)論: FCER1G啟動(dòng)子調(diào)控序列是甲基化敏感位點(diǎn)，F(xiàn)CER1G基因轉(zhuǎn)錄受DNA甲基化調(diào)控。
　　第三章STAT5/TET2對(duì)FCER1G基因啟動(dòng)子DNA甲基化及轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控的分子機(jī)制<

12、br>　　目的:探討FCER1G基因啟動(dòng)子DNA甲基化及轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控的分子機(jī)制。
　　方法:用磁珠分選法分離正常人CD14+單核細(xì)胞，用前炎癥因子GM-CSF, TSLP處理單核細(xì)胞激活STAT5信號(hào)通路，用亞硫酸鹽測(cè)序法檢測(cè)處理組與對(duì)照組單核細(xì)胞FCER1G啟動(dòng)子調(diào)控序列甲基化狀態(tài)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)FcRγ蛋白及其相關(guān)受體Dectin-2，F(xiàn)cεR1的表達(dá);用免疫共沉淀(IP)驗(yàn)證磷酸化STAT5(pSTAT5)是否募集結(jié)合DN

13、A去甲基化酶TET2，及染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)-PCR驗(yàn)證pSTAT5是否結(jié)合至單核細(xì)胞FCER1G基因啟動(dòng)子序列。
　　結(jié)果:GM-CSF，TSLP處理單核細(xì)胞激活STAT5信號(hào)通路，使單核細(xì)胞FCER1G啟動(dòng)子調(diào)控序列去甲基化、FcRγ蛋白及其相關(guān)受體Dectin-2，F(xiàn)cεR1表達(dá)升高;免疫共沉淀證實(shí)pSTAT5募集結(jié)合DNA去甲基化酶TET2，染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)證實(shí)pSTAT5結(jié)合至單核細(xì)胞FCER1G基因

14、啟動(dòng)子序列，引起該啟動(dòng)子DNA序列去甲基化。
　　結(jié)論:前炎癥因子GM-CSF, TSLP激活單核細(xì)胞pSTAT5信號(hào)通路，pSTAT5募集DNA去甲基化酶TET2，結(jié)合至FCER1G啟動(dòng)子調(diào)控序列，引起該啟動(dòng)子DNA序列去甲基化，使FcRγ及其相關(guān)受體Dectin-2，F(xiàn)cεR1表達(dá)升高。
　　第四章 Dectin-2在MoDCs對(duì)OVA攝取提呈及誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分化中的作用
　　目的:異常表達(dá)Dectin-2的單核細(xì)

15、胞來源的樹突狀細(xì)胞(MoDCs)對(duì)過敏原-卵清蛋白(OVA)提呈及T細(xì)胞Th分化的影響。
　　方法:用磁珠分選法分離正常人CD14+單核細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞，單核細(xì)胞用前炎癥因子GM-CSF預(yù)處理3天后，再用GM-CSF+IL-4處理7天體外誘導(dǎo)為MoDC，用卵清蛋白(OVA)刺激與自身CD4+T細(xì)胞共孵育3天，在免疫熒光顯微鏡下觀察MoDC Dectin-2的表達(dá)及MoDC對(duì)熒光素標(biāo)記OVA抗原(FITC-OVA)的提呈作用，用

16、CFSE標(biāo)記CD4+T細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞增殖活化活性，用RT-PCR檢測(cè)T細(xì)胞Th1/Th2細(xì)胞因子（IL-4，IL-10，IL-13，IFN-γ等）mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:與對(duì)照組相比，GM-CSF預(yù)處理組MoDC Dectin-2表達(dá)明顯增加，對(duì)FITC-OVA的提呈明顯增強(qiáng)，明顯促進(jìn)OVA反應(yīng)性T細(xì)胞增殖活化及Th2細(xì)胞因子(IL-4，IL-10，IL13) mRNA表達(dá)，向Th2分化。
　　結(jié)論: GM-