煙曲霉二肽基肽酶V肽段抗體檢測方法建立及應(yīng)用.pdf

1、曲霉是一類經(jīng)呼吸道傳播的常見條件致病性真菌，其中以煙曲霉最為常見，其感染引起的侵襲性曲霉菌病（IA）在免疫抑制和惡性腫瘤患者中的發(fā)病率和死亡率逐年上升，其中侵襲性肺曲霉病若不及時治療，死亡率極高。但是，由于IA的臨床表現(xiàn)多不具有典型性，曲霉培養(yǎng)敏感性很低，病理學(xué)檢查不易常規(guī)開展，循環(huán)中真菌抗原檢測法的敏感性和特異性還不足滿足臨床需求，因此，研究開發(fā)快速、無創(chuàng)、敏感性強、特異性高的實驗室診斷方法具有重要意義。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，IA患者

2、血清中針對曲霉優(yōu)勢抗原的抗體水平升高，檢測這些特異性抗體，有助于IA的診斷。其中二肽基肽酶V(DPPV)是優(yōu)勢抗原之一，其特異性抗體對IA診斷的價值，尚需探討。
　　研究目的:
　　選擇抗原性強的煙曲霉DPPV肽段進行原核表達;建立檢測人血清中抗DPPV肽段IgG類抗體的間接ELISA法;評估其在IA中的早期診斷價值。
　　研究方法:
　　對煙曲霉DPPV全長序列進行生物信息學(xué)分析，選取與人和其他生物同源性低、抗

3、原決定簇密集的區(qū)域分段表達。分別采用生物合成和PCR擴增技術(shù)，獲得DPPV19～144、145～446及19～447位氨基酸肽段的編碼序列。構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)獲得重組菌，IPTG誘導(dǎo)表達獲得重組肽段DPPV19-144p、DPPV145-447p及DPPV19-447p;純化后三個DPPV重組肽段與確診IA患者血清進行Westernblot分析，篩選抗原性最強的DPPV19-447p肽段作為包被抗原，建立抗

4、DPPV抗體的間接ELISA法;評估該檢測方法對侵襲性曲霉?。↖A）的診斷價值。
　　研究結(jié)果:
　　(1)煙曲霉DPPV同源性分析顯示與人源和其他病原菌蛋白的同源性低，結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗原決定簇密集分布區(qū)域，我們選擇對煙曲霉19～144、145～447和19～447位氨基酸肽段進行克隆表達基因進行克隆。構(gòu)建了相應(yīng)的工程表達菌株并誘導(dǎo)表達，獲得帶有His標(biāo)簽的DPPV19-144p、DPPV145-447p及DPPV19-447

5、p肽段，分子量分別約為15kD、35.4kD和47kD。
　　(2)經(jīng)Western blot鑒定表明煙曲霉DPPV19-144p、DPPV145-447p及DPPV19-447p重組肽段均可與IA患者血清發(fā)生特異性反應(yīng)，其中DPPV19-447p抗原性最強。以重組煙曲霉DPPV19447p肽段抗原作為建立的的ELISA方法批內(nèi)變異系數(shù)（CV)均值為4.1％和8.6％，批間CV的均值分別為7.1％和10.9％，阻斷試驗阻斷率＞90

6、％，顯示該方法穩(wěn)定性和特異性良好。
　　(3)以該法檢測IA患者組、非IA患者組和健康組血清抗DPPV19-447p抗體檢測結(jié)果顯示，選擇cut off值為0.542時，該方法對IA診斷的敏感性66.7％，特異性90.7％。在非中性粒細(xì)胞缺乏的IA患者抗DPPV肽段抗體陽性率(75.3％，55/73)高于中性粒細(xì)胞缺乏的IA患者(46.88％，15/32)，P＜0.05。
　　結(jié)論:
　　成功篩選表達了抗原性強的煙曲霉