吡咯烷二硫代氨基甲酸酯對2型糖尿病大鼠肝糖代謝的影響及肝損傷的保護作用.pdf

1、肝臟是血糖調(diào)節(jié)的重要器官，肝糖代謝對維持機體葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)(glucose homeostasis)起了關(guān)鍵性作用，肝臟對于血糖的調(diào)節(jié)主要是通過糖原合成和糖異生來實現(xiàn)的。機體攝入高碳水化合物飲食后，胰島素分泌增多，一方面促進肝臟糖原合成增加，另一方面使肝臟糖異生減少，結(jié)果使肝糖輸出減少，從而防止餐后血糖升高；空腹或饑餓狀態(tài)下，胰島素分泌減少，胰高血糖素釋放增多，肝臟糖原分解，糖異生酶表達增多，肝糖輸出增多。胰島素絕對不足或功能障礙，而使

2、肝糖原合成及糖異生功能異常，肝臟糖代謝功能失調(diào)，是糖尿病血糖升高的重要原因。
　　 吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)為二硫氨基酸酯，其分子上含有巰基(thiol)結(jié)構(gòu)，具有抗氧化及金屬螯合作用。PDTC可以特異性抑制NF-κB活性，有效抑制氧化應(yīng)激所致的NF-κB的過度表達，可阻止細胞因子誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)基因表達，因此具有抗炎作用。
　　 新近研究表明，PDTC的生物

3、學(xué)作用涉及多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。有研究證實PDTC可以通過PI3K/Akt信號途徑使Akt的磷酸化水平增加。多項研究證實，PDTC可降低糖尿病大鼠血糖水平，但是對PDTC抗糖尿病的機制少有報道。本研究以高脂喂養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型，并用PDTC(50mg·/kg體重)干預(yù)1周后，觀察PDTC對糖尿病大鼠血糖及血脂代謝的影響，以及肝臟的保護作用；PDTC通過Akt/Fo

4、xO1信號通路對肝糖異生影響以及PDTC通過Akt/GSK/GS信號通路對肝臟糖原合成的影響，探討信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。實驗內(nèi)容主要包括以下4部分：
　　 第一部分、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯對糖尿病大鼠糖脂代謝的影響
　　 目的：觀察吡咯烷二硫代氨基甲酸脂對糖尿病大鼠血糖及血脂代謝的影響。
　　 方法：
　　 1.動物模型建立、分組及標本處理
　　 參照Reed等方法建立2型糖尿病大鼠模型：雄性Wistar

5、大鼠，隨機分為兩組，12只為正常對照組(normal control， NC組)，喂普通飼料，37只為高脂飲食組（high-fat， HF組），喂高脂飼料。實驗期間動物自由攝取食物和水，體重每周記錄1次。喂養(yǎng)8周后，經(jīng)口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test， OGTT）和胰島素耐量試驗(insulin tolerance test， ITT)證實高脂飲食組產(chǎn)生胰島素抵抗后，過夜禁食12小時，給予一次性

6、腹腔注射鏈脲佐菌素27mg/kg體重，對照組大鼠給予同體積檸檬酸緩沖液腹腔注射，3天后隨機血糖≥16.7mmol/L為2型糖尿病模型成功。共有36只大鼠成模，后隨機分為三組，12只為糖尿病模型組(DM)，12只為PDTC治療組(DM+P)，12只為胰島素對照組(DM+INS)。PDTC治療組給PDTC腹腔注射治療（50mg/kg體重），每天1次，連續(xù)治療1周，正常對照組、DM和DM+INS組給同體積的生理鹽水腹腔注射。
　　 治

7、療1周后，過夜禁食12小時，PDTC治療組處死前1小時給PDTC(50mg/kg)腹腔注射治療，胰島素組處死前1小時給胰島素1U/kg體重一次性腹腔注射，其它組給生理鹽水腹腔注射。處死前用快速血糖儀檢測尾靜脈血糖，斷頭處死，留取血液及肝臟。
　　 2.血糖、胰島素的測定
　　 血糖采用葡萄糖氧化酶法測定，胰島素采用ELISA法測定。應(yīng)用穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeoestasis model assessment o

8、f insulin resistance， HOMA-IR)及胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index， ISI)評價胰島素抵抗的程度。HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5表示胰島素抵抗的程度；ISI=1/(FBG×FINS)，表示胰島素敏感性，均使用自然對數(shù)表示。
　　 3.口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)和胰島素耐量試驗(ITT)
　　 OGTT:以2g/kg體重葡萄糖灌胃，分別測定

9、0min、30min、60min、90min、120min血糖及胰島素水平。
　　 ITT:給予1U/kg生物合成人胰島素腹腔注射，分別測定各組大鼠0min、15min、30min、60min、90min的血糖水平。
　　 4.血脂的測定
　　 用全自動生化分析儀測定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平，采用Cu2+比色法測定游離脂肪酸(FF

10、A)的水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.兩組大鼠空腹體重的比較
　　 實驗開始時，隨機分為正常對照組大鼠(NC組)和高脂飲食組(HF組)，兩組大鼠體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異。喂養(yǎng)4周后，HF組大鼠體重(306.00±15.81g)較NC組大鼠體重(252.90±27.80g)增加明顯(P＜0.01)。喂養(yǎng)8周后，HF組大鼠體重（361.92±19.22g）明顯高于NC組(313.17±19.95g)(P＜0.01)。

11、　　 2.兩組大鼠空腹血糖、胰島素含量、HOMA-IR和ISI的比較
　　 大鼠喂養(yǎng)8周后，HF組與NC組空腹血糖無統(tǒng)計學(xué)差異；HF組大鼠胰島素水平（18.01±2.63μIU/ml）明顯高于NC組大鼠(10.67±0.83μIU/ml)(P＜0.05);HF組HOMA-IR（1.22±0.17）明顯高于NC組(0.68±0.09)(P＜0.05);HF組ISI(-4.43±0.17)明顯低于NC組(-3.79±0.09)(P

12、＜0.05)。
　　 3.兩組大鼠OGTT和ITT的結(jié)果
　　 大鼠喂養(yǎng)8周后，OGTT結(jié)果顯示：HF組大鼠各時間點血糖水平均較NC組明顯升高，其中90min、120min兩個時間點血糖水平比較，有顯著性差異(P＜0.05)；HF組大鼠各時間點胰島素水平較NC組均明顯升高(P＜0.05)。ITT結(jié)果顯示：HF組大鼠腹腔注射胰島素后15min、60min、90min三個時間點血糖水平明顯高于NC組（P＜0.05）
　

13、　 4.造模及治療后各組大鼠血糖的比較
　　 大鼠注射STZ72h后，DM組大鼠空腹血糖(26.16±3.38mmol/L)明顯高于NC組(4.41±0.56mmol/L)（P＜0.01）。PDTC治療1周后，DM組大鼠空腹血糖(26.55±2.90mmol/L)仍明顯高于NC組(5.58±0.43mmol/L)(P＜0.01)；PDTC治療組大鼠空腹血糖(11.55±2.89mmol/L)較DM組明顯降低（P＜0.01）。<

14、br>　　 5.治療后各組大鼠血脂的比較
　　 DM組大鼠的TC(8.79±1.83mmol/L)、TG(1.12±0.31mmol/L)、LDL(1.72±0.28mmol/L)、FFA(1.82±0.14mEq/L)，均明顯高于NC組TC(2.18±0.11mmol/L)、TG(0.66±0.07mmol/L)、LDL(1.10±0.07mmol/L)、FFA(1.27±0.13mEq/L)，（均P＜0.05）；PDTC治

15、療組TG(0.70±0.10mmol/L)與DM組比較，明顯降低(P＜0.05)；其它血脂水平均無明顯改善(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過高脂飲食可造成大鼠對胰島敏感性降低，再給予小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射，可成功制備2型糖尿病大鼠模型。
　　 2.PDTC能夠降低糖尿病大鼠血糖水平，對血脂無明顯作用。
　　 第二部分、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯對糖尿病大鼠肝糖原合成的影響及機制
　　

16、目的：探討吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)對糖尿病大鼠肝糖原合成的影響及機制。
　　 方法：取大鼠肝臟組織，以KOH堿液煮沸溶解，用葸酮比色法測定大鼠肝臟中糖原含量；在液氮中研磨粉碎大鼠肝臟組織，提取組織中蛋白，Western blot檢測大鼠肝臟中蛋白激酶B(PKB/Akt)和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)磷酸化水平的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.PDTC對糖尿病大鼠肝糖原合成的影響
　　 D

17、M組大鼠肝糖原含量(5.92±0.99mg/g)與NC組（11.59±1.96mg/g）相比明顯減少，有顯著性差異（P＜0.01），經(jīng)過藥物干預(yù)后，DM+P組（8.77±1.00mg/g）和DM+INS組（10.25±1.76mg/g）肝糖原含量增加較DM組肝糖原含量均明顯增加(均P＜0.01)。
　　 2.PDTC對糖尿病大鼠肝組織Akt磷酸化水平的影響
　　 DM組大鼠Akt磷酸化水平(0.43±0.05)與NC組(

18、0.94±0.07)比較明顯降低（P＜0.01），經(jīng)過藥物干預(yù)后，DM+P組(1.23±0.10)和DM+INS組（1.43±0.11）Akt磷酸化水平與DM組相比均有明顯增加(均P＜0.01)。
　　 3.PDTC對糖尿病大鼠肝組織GSK-3β磷酸化水平的影響
　　 DM組GSK-3β磷酸化水平（0.40±0.04）與NC組相比明顯降低(0.64±0.07)(P＜0.01)，經(jīng)過藥物干預(yù)后，DM+P組（0.78±0.0

19、5）和DM+INS組（0.84±0.03）GSK-3β磷酸化水平與DM組相比均有明顯增加（均P＜0.01）。
　　 結(jié)論：PDTC可使2型糖尿病大鼠肝臟中蛋白激酶B(Akt)和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)磷酸化水平增加。PDTC通過調(diào)控Akt/GSK-3β活性，增加肝糖原合成，降低血糖。
　　 第三部分、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯對糖尿病大鼠肝糖異生的影響及機制
　　 目的：探討吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDT

20、C)對糖異生酶基因表達的影響，及其影響肝臟糖異生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。
　　 方法：取大鼠肝臟組織，液氮中研磨粉碎，提取組織蛋白及RNA， Western blot分析大鼠肝臟中FoxO1磷酸化水平的變化；Real time-PCR檢測肝臟PEPCK及G6Pase的mRNA表達量的變化；用OCT膠包埋肝臟組織，冰凍切片機切片，經(jīng)免疫熒光染色，通過激光共聚焦顯微鏡觀察FoxO1在細胞漿與細胞核分布的改變。
　　 結(jié)果：
　

21、　 1.PDTC對糖尿病大鼠肝組織FoxO1活性的影響
　　 DM組FoxO1磷酸化水平（0.06±0.01）與NC組(0.77±0.06)相比明顯降低（P＜0.01），經(jīng)過藥物干預(yù)后，DM+P組（0.64±0.07）和DM+INS組（0.71±0.07）FoxO1磷酸化水平與DM組相比均有明顯增加(均P＜0.01)。
　　 2.PDTC對糖尿病大鼠肝組織中FoxO1細胞亞定位的影響
　　 共聚焦顯微鏡顯示，D

22、M組大鼠肝細胞胞漿中FoxO1水平較NC組明顯降低，DM+P組和DM+INS組胞漿中FoxO1水平較DM組大鼠明顯增加。
　　 3.PDTC對糖尿病大鼠肝組織中肝糖異生酶PEPCK和G6Pase的影響
　　 DM組大糖異生酶PEPCK（1.77±0.32）和G6Pase mRNA（3.20±0.76）相對表達量與NC組PEPCK（1.04±0.19）和G6Pase mRNA（1.02±0.08）比較明顯升高（均P＜0.0

23、l），經(jīng)過藥物干預(yù)后，DM+P組PEPCK（0.87±0.19）、G6Pase（0.82±0.18）和DM+INS組PEPCK（0.51±0.13）、G6Pase(0.62±0.11)mRNA相對表達量與DM組相比明顯降低(均P＜0.01)。
　　 結(jié)論：PDTC通過Akt/FoxO1信號途徑，使FoxO1發(fā)生磷酸化。磷酸化的FoxO1發(fā)生核漿轉(zhuǎn)位，使PEPCK及G6Pase mRNA生成減少，減少肝臟糖異生，進而降低血糖。

24、r>　　 第四部分、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯對糖尿病大鼠的肝臟保護作用
　　 目的：觀察吡咯烷二硫代氨基甲酸酯對糖尿病大鼠肝臟損傷的保護作用，以及其機制。
　　 方法：取大鼠肝臟組織，液氮中研磨粉碎，提取組織中RNA，應(yīng)用RT-PCR檢測肝組織中誘生型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA的表達量。大鼠肝臟組織經(jīng)10％福爾馬林溶液固定24h后，石蠟包埋后制備組織切片，用HE染色及iNOS、NT組化染色，觀察大鼠肝臟損傷情況。

25、
　　 結(jié)果：
　　 1.肝臟組織大體觀及HE染色結(jié)果
　　 HE染色結(jié)果：NC組肝細胞形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整；DM組大鼠與NC組比較，肝臟明顯脂肪變性，肝細胞邊界不清，細胞排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊不清。DM+P組肝細胞形態(tài)恢復(fù)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)尚清，脂肪變性及肝細胞損傷明顯減輕。
　　 2.誘生型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA的表達
　　 DM組（1.29±0.12）iNOS mRNA的

26、表達較NC組（0.19±0.03）明顯升高（P＜0.01），DM+P組iNOS mRNA的表達量（0.22±0.04）較DM組明顯降低(P＜0.01)。
　　 3.免疫組化觀察各組大鼠肝臟中iNOS、NT的表達
　　 在DM組大鼠中，iNOS的表達水平和NT的生成明顯高于NC組；在DM+P組iNOS的表達水平和NT的生成明顯低于DM組。
　　 結(jié)論：高糖條件下誘發(fā)氧化應(yīng)激，iNOS表達及NT生成增多，在肝臟損傷起