吡咯烷二硫代氨基甲酸酯對2型糖尿病大鼠大血管損傷的保護作用.pdf

1、目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)已成為21世紀威脅人類生命健康的慢性重大疾病之一。糖尿病大血管并發(fā)癥是2型糖尿病致死致殘的首要因為,據(jù)統(tǒng)計超過70％的DM患者死于糖尿病血管病變。近年來,大量證據(jù)表明糖尿病大血管病變與過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite,ONOO-)產(chǎn)生過多有關。高血糖可誘導血管內(nèi)皮誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達增多,一氧化氮(NO)生成量明顯增多,過量生成的NO具有細胞毒性作用。其次

2、,過量生成的NO還可與超氧陰離子(O-2)迅速結合生成氧化作用更強的ONOO-。ONOO-可使蛋白質酪氨酸殘基或游離酪氨酸發(fā)生硝基化反應,形成最終產(chǎn)物硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT)。蛋白質硝基化后能誘導酶活性的喪失、細胞的壞死和凋亡。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)為二硫氨基酸酯,因其分子所含巰基(thiol)結構,具有抗氧化及金屬螯合作用,可以特異性抑制NF-κ

3、B活性,有效抑制氧化損傷所致的NF-κB活性的表達,減少多種炎癥介質的表達,從而改善內(nèi)皮細胞功能。
　　 已有多項研究表明,PDTC可降低糖尿病大鼠血糖水平。本實驗研究目的在于觀察鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導的高脂高糖喂養(yǎng)的2型糖尿病大鼠模型中主動脈血管內(nèi)皮iNOS表達、NT生成的變化,并應用PDTC進行干預,觀察其整體降糖作用及對主動脈血管內(nèi)皮iNOS表達及NT生成的影響,為預防和延緩糖尿病大血管病變

4、提供理論依據(jù)和有效治療方法。
　　 方法:參照Reed等方法建立2型糖尿病大鼠模型。8周齡健康雄性Wistar大鼠37只,體重180-210g,由河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供(許可證號(冀)2008-1-003,批號:901010)。隨機分為正常對照組(NC組)12只和高脂飲食組(HFD組)25只,NC組喂以標準大鼠飼料,HFD組喂以高脂高糖飼料,8周后HFD組經(jīng)口服葡萄糖耐量試驗和胰島素耐量試驗證實出現(xiàn)胰島素抵抗時,給予一次性

5、腹腔注射鏈脲佐菌素27mg/kg,NC組大鼠給予等體積檸檬酸緩沖液腹腔注射,72h后,尾靜脈取血測定空腹血糖≥7.8mmol/L者為2型糖尿病大鼠。再將HFD組的糖尿病大鼠隨機分為糖尿病組(DM組)和PDTC治療組(PDTC組)。PDTC治療組每日腹腔注射PDTC50mg/kg,NC組和DM組每日給予等體積的蒸餾水腹腔注射。實驗末,PDTC治療組1只大鼠因行胰島素耐量時出現(xiàn)低血糖而死亡,正常對照組(NC組)大鼠12只,糖尿病組(DM組)

6、12只,PDTC治療組(PDTC組)大鼠剩余12只。
　　 每組大鼠于實驗開始、注射STZ前及實驗結束時均稱重、取血。每組大鼠于注射STZ之前和注射STZ10天后做口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)和胰島素耐量試驗(ITT)。大鼠自采血前一日20:00起禁食,實驗日8:00分別從內(nèi)眥靜脈取血3ml,分離血清,用于各指標的檢測。PDTC治療1周末,斷頭處死動物,分別留取胸主動脈檢測各指標。
　　 1.血糖、胰島素的測定

7、　　 血糖采用葡萄糖氧化酶法測定。胰島素采用ELISA法測定。應用穩(wěn)態(tài)模型(Homeoestasis Model Assessment,HOMA)及胰島素抵抗指數(shù)(Insulin Sensitivity Index,ISI)評價胰島素抵抗的程度。
　　 2.口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)、胰島素耐量試驗(ITT)
　　 OGTT以2g/kg葡萄糖灌胃,分別測定0、30min、60min、90min、120min血糖水平

8、。ITT以1IU/kg生物合成人胰島素腹腔注射,分別測0、15min、30min、60min、90min血糖水平。
　　 3.血脂的測定
　　 使用全自動生化分析儀測定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平,采用Cu2+比色法測定游離脂肪酸(FFA)水平。
　　 4.SOD、GSH-PX、MDA的測定
　　 制備組織勻漿,低溫離心機300

9、0r/min離心10-15min,留上清棄沉淀,然后嚴格按照試劑盒說明分別測定SOD、GSH-PX、MDA。
　　 5.各組大鼠主動脈組織學變化
　　 各組大鼠主動脈組織分別進行石蠟切片,常規(guī)HE染色,在光鏡下觀察主動脈組織形態(tài)學變化。
　　 6.免疫組化觀察各組大鼠主動脈內(nèi)皮iNOS、NT的表達
　　 選用各組大鼠主動脈組織分別進行石蠟切片,經(jīng)常規(guī)免疫組化染色,在光鏡下觀察主動脈內(nèi)皮細胞iNOS、NT的

10、含量變化。
　　 7.免疫熒光觀察各組大鼠主動脈內(nèi)皮iNOS、NT的表達
　　 常規(guī)方法制備大鼠主動脈石蠟切片,行免疫熒光染色,在熒光顯微鏡下觀察主動脈內(nèi)皮細胞iNOS、NT的含量變化。
　　 8.統(tǒng)計學處理
　　 所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件處理。計量資料以(x)±s表示,組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗進行比較。顯著性用P值表示,P<0.05為差異有顯著性。
　　 結論:
　　 1通過

11、高脂高糖飲食及小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射,可成功制各2型糖尿病大鼠模型,并且出現(xiàn)糖尿病大鼠大血管早期病理改變。
　　 22型糖尿病大鼠大血管氧化防御受損,氧化還原嚴重失衡,同時血管內(nèi)皮細胞iNOS表達、NT生成明顯增多,表明氧化應激損傷在糖尿病大血管病變的發(fā)生中起重要作用。
　　 3 PDTC不僅具有降血糖作用,而且可以減少iNOS的表達,進而減少ONOO-及NT的產(chǎn)生,延緩了糖尿病大血管并發(fā)癥的發(fā)生。早期應用PDTC可預