膠質(zhì)瘤順鉑化療后DNA損傷檢控點(diǎn)ATM基因的表達(dá)變化及ATM基因慢病毒RNAi載體構(gòu)建.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 化療前后不同時(shí)期膠質(zhì)瘤組織中ATM的表達(dá)變化和意義
　　目的：探索化療前后不同時(shí)期膠質(zhì)瘤組織中ATM表達(dá)及變化規(guī)律，為確定分子靶向干預(yù)的最佳時(shí)機(jī)提供依據(jù)。
　　方法：利用人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞裸鼠皮下異位移植制作膠質(zhì)瘤模型，通過順鉑對(duì)荷瘤裸鼠進(jìn)行化療(5mg／kg／d連續(xù)腹腔注射4—5天)，建立膠質(zhì)瘤化療和化療后進(jìn)展模型。利用功能分類基因芯片系統(tǒng)檢測(cè)化療前后不同時(shí)期膠質(zhì)瘤組

2、織中ATM的表達(dá)情況,并利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和免疫組織化學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATM在化療前后不同時(shí)期表達(dá)出現(xiàn)明顯變化，其中在化療結(jié)束時(shí)表達(dá)顯著增強(qiáng)，在化療后腫瘤消退至最小時(shí)ATM表達(dá)又明顯降低，然而在膠質(zhì)瘤進(jìn)展時(shí)其表達(dá)再次明顯增強(qiáng)，定量RT-PCR和免疫組化結(jié)果與此相一致。
　　結(jié)論：化療前后不同時(shí)期膠質(zhì)瘤組織中ATM的表達(dá)呈動(dòng)態(tài)變化，化療結(jié)束時(shí)和腫瘤進(jìn)展期表達(dá)明顯上調(diào)。
　　第二部分 ATM基因慢病毒

3、RNAi載體的構(gòu)建
　　目的：構(gòu)建ATM基因RNAi慢病毒載體，并檢測(cè)其體外抑制U251和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ATM的表達(dá)效率，為后續(xù)進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：設(shè)計(jì)篩選ATM基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的oligo DNA，退火形成雙鏈DNA，并與經(jīng)AgeI和EcoRI酶切后的pGCSIL—GFP載體連接產(chǎn)生攜帶ATM基因的慢病毒載體，PC R篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序鑒定,并和pHelper1.0、pHelper2.0載

4、體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T細(xì)胞，產(chǎn)生慢病毒ATM-RNAi-LV，以293T細(xì)胞GFP蛋白的表達(dá)水平測(cè)定病毒滴度。慢病毒ATM-RNAi-LV轉(zhuǎn)染U251和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，RT--PCR檢測(cè)ATM的表達(dá)抑制效率。
　　結(jié)果：PCR和測(cè)序結(jié)果證實(shí)，成功構(gòu)建慢病毒了ATM基因shRNA的慢病毒載體。慢病毒ATM-RNAi-LV1和ATM-RNAi-LV2原液滴度分別為3×108TU/mL和7×108TU/mL，在體外U251和U87