抑癌基因KLF6的克隆及質(zhì)粒構(gòu)建并轉(zhuǎn)染膀胱癌BIU-87細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染的pEGFP-C1-KLF6質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染膀胱癌BIU-87細(xì)胞，并研究其轉(zhuǎn)染情況，有助于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，同時(shí)可為膀胱癌的基因治療提供新的選擇。
　　方法：
　　1、目的基因的獲取及質(zhì)粒的構(gòu)建：提取RNA并設(shè)計(jì)KLF6的引物序列，RT-PCR克隆目的基因，BamH I和EcoR I雙酶切KLF6和質(zhì)粒載體pEGFP-C1后進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建含有目的基因KLF6的重組質(zhì)粒pEGFP-C1-K

2、LF6；
　　2、質(zhì)粒擴(kuò)增及轉(zhuǎn)染：對(duì)重組pEGFP-C1-KLF6質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，以達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需要的數(shù)量并進(jìn)行純化。采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)將含或不含 KLF6的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入BIU-87細(xì)胞，分別作為轉(zhuǎn)染組和空載體組，對(duì)照組選用未轉(zhuǎn)染的 BIU-87細(xì)胞；
　　3、RT-PCR和Western檢測(cè)轉(zhuǎn)染后KLF6 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、成功獲得目的基因并構(gòu)建pEGFP-C1-KLF6質(zhì)粒，使其可進(jìn)

3、行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)使用。
　　2、重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)擴(kuò)增、抽提并純化，經(jīng)電泳檢驗(yàn)與擴(kuò)增前重組pEGFP-C1-KLF6質(zhì)粒位置一樣。
　　3、實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組及空載體組在熒光顯微鏡下觀察未見(jiàn)熒光，轉(zhuǎn)染組在熒光顯微鏡下可見(jiàn)60％左右細(xì)胞內(nèi)具有綠色熒光。
　　4、RT-PCR和Western實(shí)驗(yàn)均可檢測(cè)到轉(zhuǎn)染組KLF6 mRNA和蛋白的表達(dá)，而對(duì)照組和空載體組則未見(jiàn)明顯表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1、構(gòu)建成功的pEGFP-C1