AIP1調(diào)控血管增生的分子機(jī)制及對小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)生的影響.pdf

1、AIP1(ASK1相互作用蛋白-1)或稱DAB2相互作用蛋白，是近來鑒定的Ras—GTP酶活化蛋白家族新成員，參與細(xì)胞生長抑制和細(xì)胞凋亡。然而，AIP1體內(nèi)的功能研究并不清楚。本實驗采用血管研究常用的動物模型觀察AIP1對血管增生調(diào)控的表型，并探討其內(nèi)部的分子機(jī)制；進(jìn)而，以視網(wǎng)膜血管發(fā)生模型研究AIP1對血管生成的影響。 第一部分AIP1作為內(nèi)源性抑制因子調(diào)控VEGFR2信號介導(dǎo)的血管增生 目的：研究AIP1基因在體內(nèi)對

2、血管增生的調(diào)控功能及其分子機(jī)制。 方法：以AIP1基因敲除鼠(AIP1-KO)為研究對象，采用不同的實驗動物模型包括小鼠后肢缺血模型及VEGF誘導(dǎo)的耳廓皮膚，角膜和視網(wǎng)膜新生血管模型觀察血管增生的表型；進(jìn)而，過表達(dá)AIP1研究血管表型的改變。同時，通過VEGF依賴的血管增生體外模型包括血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管樣結(jié)構(gòu)形成實驗，研究AIP1對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。此外，在分子機(jī)制研究方面，不同時間點內(nèi)皮細(xì)胞VEGF處理，Wester

3、nblot檢測AIP1敲除對VEGFR2信號通路(VEGFR2、PLC—γ和Akt磷酸化)的影響。免疫共沉淀分析AIP1是否直接結(jié)合于VEGFR2受體形成復(fù)合體而抑制VEGFR2信號。為研究AIP1跟VEGFR2結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，載體編碼表達(dá)的全長AIP1(AIP1-F)，AIP1-N或AIP1-C與VEGFR2共表達(dá)，AIP1-VEGFR2的結(jié)合通過免疫共沉淀分析。VEGFR2與不同AIP1突變體(N，PR，PHC2)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染無內(nèi)源性V

4、EGFR2表達(dá)的293T細(xì)胞，檢測不同的AIP1突變體對VEGFR2依賴的信號通路的抑制。 結(jié)果：縱觀各種血管增生模型，一致的表型是AIP1-KO鼠表現(xiàn)出顯著的血管增生，伴隨異常增強(qiáng)的VEGF—VEGFR2信號。視網(wǎng)膜VEGF誘導(dǎo)的血管增生可以被過表達(dá)AIP1所抑制，一致的是，體外實驗中內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)AIP1可以抑制(但敲除或沉默AIP1后增強(qiáng))VEGF誘導(dǎo)的VEGFR2信號和內(nèi)皮細(xì)胞遷移。分子機(jī)制研究表明，在VEGF反應(yīng)的后期

5、，AIP1被募集到VEGFR2-PI3K復(fù)合體，導(dǎo)致VEGFR2依賴的信號通路抑制。AIP1的C2結(jié)構(gòu)域?qū)EGFR2結(jié)合極為重要。AIP1通過不同結(jié)構(gòu)域，作用于VEGFR2和PI3Kp85，導(dǎo)致VEGFR2依賴的血管增生信號抑制。 結(jié)論：AIP1作為內(nèi)源性抑制因子直接與VEGFR2結(jié)合并抑制VEGFR2介導(dǎo)的血管增生。 第二部分AIP1基因?qū)π∈笠暰W(wǎng)膜血管發(fā)生的影響 目的：研究AIP1對小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)生的影響

6、，并探討相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制。 方法：觀察新生AIP1-WT、AIP1-KO小鼠視網(wǎng)膜(代表了生理性的血管增生)以及氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管病變(OIR)小鼠模型(代表了病理性血管增生)血管形態(tài)，研究AIP1對視網(wǎng)膜衄管發(fā)生的影響；進(jìn)而以小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞為工具研究相應(yīng)的信號調(diào)控途徑。 結(jié)果：在出生后早期AIP1-KO小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育明顯慢于AIP1-WT鼠。GFAP及VE-cadherin的表達(dá)也相應(yīng)減弱。WesternBl

7、ot檢測VEGFR2-Dll4-Notch1cleaved呈大致同向變化，即P4、P5逐漸增加，VEGFR2在P5達(dá)到峰值，但在P7Dll4表達(dá)升至峰值時VEGFR2的表達(dá)卻明顯下降，我們驗證了高表達(dá)至一定程度的Dll4對VEGFR2有負(fù)向調(diào)控作用。進(jìn)而，mRNA表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)AIP1-KO鼠視網(wǎng)膜Notch1及其下游分子Hey1明顯增加，但另一與血管增生及成熟關(guān)系密切的細(xì)胞因子PDGFBB受體PDGFRβ無顯著的表達(dá)差異。因為Dll4活

8、化可以引起血管出芽減少，血管生長緩慢，我們證實AIP1通過Notch-Dll4依賴的信號通路調(diào)控早期視網(wǎng)膜的血管發(fā)育。此外，從小鼠OIR模型可見，P17AIP1-KO鼠視網(wǎng)膜可見顯著的血管出芽和分枝形成。WesternBlot分析AIP1-KO鼠視網(wǎng)膜的VEGFR2表達(dá)高于AIP1-WT鼠，這種高表達(dá)可以被高氧抑制。相對低氧情況下，視網(wǎng)膜VEGFR2重新被誘導(dǎo)，恢復(fù)高表達(dá)狀態(tài)，在AIP1-KO鼠的增加更為顯著。但是，作為血管增生的內(nèi)源性

9、抑制因子PEDF無論高氧還是相對低氧，AIP1-KO鼠的表達(dá)都高于AIP1-WT；低氧時，AIP-KO鼠PEDF的表達(dá)比常氧狀態(tài)增加。說明PEDF不但拮抗低氧誘導(dǎo)的血管增生，而且參與拮抗AIP1依賴的VEGFR2介導(dǎo)的血管增生。P17時Dll4表達(dá)輕微增加但血管出芽和發(fā)生沒有顯著抑制，說明Notch信號在病理性血管增生并沒有起主要的調(diào)控作用。 分子機(jī)制研究，AIP1-WT鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(MREC)VEGF處理30分鐘時，

10、Dll4表達(dá)第一次達(dá)到高峰，但隨后逐漸下降，2h重新表達(dá)顯著增強(qiáng)；Notch1的被動活化形態(tài)與Dll4完全一致。但在Dll4表達(dá)高峰時(30min、2h)，VEGFR2的表達(dá)相應(yīng)減弱，說明VEGF誘導(dǎo)的Dll4高表達(dá)存在對VEGFR2的負(fù)向調(diào)控。值得注意的是，AIP1的表達(dá)在此時也顯著增強(qiáng)。我們推測AIP1可能協(xié)同Dll4，共同抑制了VEGFR2活化。而在AIP1-KOMRECVEGF處理后，Dll4立即達(dá)到峰值，隨后下降，在1h后重新