胰島素對2型糖尿病大鼠下頜骨組織蛋白表達(dá)的影響及相關(guān)機(jī)制的初步研究.pdf

1、人工種植技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到牙齒缺失、頜骨缺損等多個方面，成為一種成熟可靠的修復(fù)方法。但對于糖尿病患者的人工種植體存在風(fēng)險，臨床調(diào)查研究顯示，糖尿病患者的種植1年成功率約為84.3-90％，要明顯低于非糖尿病患者的95%。
　　糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，分為1型和2型，糖尿病患者中有90%為2型糖尿病，并且其發(fā)病率逐年升高。研究已證實，2型糖尿病會導(dǎo)致人或者動物模型的骨組織鈣磷流失，骨代謝異常，以及骨結(jié)構(gòu)和骨質(zhì)量發(fā)

2、生改變。種植體骨整合是人工種植體修復(fù)成功的基礎(chǔ)，而2型糖尿病導(dǎo)致種植體周圍骨形成減少、骨愈合不良以及組織愈合延遲。動物實驗同樣證實糖尿病大鼠種植體周圍骨形成障礙，骨形成過程中的關(guān)鍵因子低于正?；钚员憩F(xiàn)。
　　骨形成是一個復(fù)雜的過程，成骨發(fā)生的關(guān)鍵是骨髓基質(zhì)細(xì)胞向骨形成轉(zhuǎn)變，分化為成骨細(xì)胞，繼而成骨細(xì)胞分化，完成細(xì)胞外基質(zhì)的合成、沉積和礦化。研究證實，高糖環(huán)境下骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化能力減弱，成骨細(xì)胞的增殖和礦化能力也減弱，這些都被認(rèn)

3、為是糖尿病導(dǎo)致骨質(zhì)下降的原因，但其機(jī)制尚不清楚。
　　胰島素是一種重要的細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)激素，是目前控制血糖的有效藥物。胰島素能促進(jìn)細(xì)胞的生長和分化，尤其是對骨代謝相關(guān)細(xì)胞的作用受到廣泛關(guān)注。研究證實，胰島素可通過直接或間接作用促進(jìn)成骨合成，預(yù)防骨流失，從而提高骨密度和骨強(qiáng)度，因此，胰島素的應(yīng)用可以改善2型糖尿病對骨質(zhì)的影響，但其影響機(jī)制尚不清楚。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于研究某種疾病全蛋白的定性和定量表達(dá)，被視為一種強(qiáng)大的

4、研究疾病相關(guān)蛋白的方法，其可為不同的細(xì)胞、組織和生物過程提供參考圖和數(shù)據(jù)庫。蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)應(yīng)用于糖尿病及骨組織的研究，但迄今為止，對于胰島素及2型糖尿病對下頜骨中全蛋白的影響未見報道，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究有助于探討2型糖尿病對頜骨的影響機(jī)制，以及胰島素改善2型糖尿病對頜骨影響的機(jī)制。
　　第一部分胰島素對2型糖尿病大鼠下頜骨組織蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　目的：探討2型糖尿病大鼠與正常大鼠下頜骨組織表達(dá)的蛋白差異以及胰島素對

5、差異蛋白的影響。內(nèi)容：對正常大鼠（Wistar大鼠）、2型糖尿病大鼠（Goto-Kakizaki大鼠）以及給予胰島素（Insulin）治療2周的糖尿病大鼠的下頜骨組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。根據(jù)結(jié)果篩選出受胰島素調(diào)控的蛋白，進(jìn)一步應(yīng)用Q-PCR檢測受調(diào)控蛋白的mRNA在正常大鼠、糖尿病大鼠、以及胰島素分別治療2周和4周的糖尿病大鼠下頜骨組織中的表達(dá)。結(jié)果：經(jīng)過雙向凝膠電泳及MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析，成功鑒定Wistar大鼠和GK大

6、鼠下頜骨組織間差異顯著的蛋白點(diǎn)36個，主要分屬于6大功能：代謝、蛋白結(jié)合、細(xì)胞支架、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答。其中10個蛋白的表達(dá)顯著受胰島素的調(diào)控。Q-PCR結(jié)果顯示，胰島素可改善10個差異蛋白mRNA在GK大鼠頜骨組織中的表達(dá)，且給予4周胰島素治療的作用顯著。結(jié)論：蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠同正常大鼠下頜骨表達(dá)的差異蛋白，可作為研究2型糖尿病對頜骨代謝影響的新靶點(diǎn)。
　　第二部分胰島素對高糖環(huán)境下prohibiti

7、n和peroxiredoxin-6在大鼠頜骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化過程中表達(dá)的影響
　　目的：探討高糖環(huán)境下prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白在大鼠頜骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化過程中的表達(dá)及胰島素對其表達(dá)的影響。方法：從Wistar大鼠下頜骨中分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞。MTT法檢測在不同葡萄糖濃度(5.5、25、45mM)及不同胰島素濃度（0，10-7，10-6和10-5M）培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞1、3、5、7、10d，細(xì)胞

8、的增殖情況；將細(xì)胞分別于不同糖濃度下（5.5、25、45mM）及胰島素(0、10-5mol/L)的干預(yù)下成骨誘導(dǎo)。礦化21d，茜素紅染色，礦化定量分析，觀察對細(xì)胞礦化的影響。礦化誘導(dǎo)1、3、7、14、21d，ELISA試劑盒檢測prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白的表達(dá)。結(jié)果：①與5.5mM糖濃度相比，25mM高糖環(huán)境中rBMSC的增殖活性增強(qiáng)，45mM高糖環(huán)境中rBMSC的增殖活性顯著下降；②10-5M胰島素可顯著

9、提高rBMSC在三種糖濃度中的增殖活性；③與5.5mM糖濃度相比，25mM組可見少量散在的礦化基質(zhì)，但45mM組未見明顯的礦化結(jié)節(jié)，胰島素可改善高糖環(huán)境下rBMSC鈣結(jié)節(jié)的形成；④高糖環(huán)境下，prohibitin和peroxiredoxin-6在rBMSC成骨分化表達(dá)下降，45mM組蛋白下降尤為顯著，10-5M胰島素可上調(diào)高糖環(huán)境中prohibitin和peroxiredoxin-6的表達(dá)；⑤Prohibitin蛋白在rBMSC成骨分化

10、的第3d表達(dá)顯著，peroxiredoxin-6蛋白則在rBMSC成骨分化第21d表達(dá)顯著。結(jié)論：高糖環(huán)境抑制rBMSC的增殖和礦化，胰島素可改善這種抑制作用。Prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白分別在rBMSC成骨分化早期和后期起到重要作用。高糖環(huán)境對prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白在rBMSC成骨分化過程中的表達(dá)有抑制作用，胰島素可改善高糖的抑制作用。
　　第三部分胰島素對高糖環(huán)境下

11、prohibitin和peroxiredoxin-6在大鼠成骨細(xì)胞（ROS17/2.8）分化過程中表達(dá)的影響
　　目的：探討高糖環(huán)境下prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白在大鼠成骨細(xì)胞分化過程中的表達(dá)變化及胰島素對其表達(dá)的影響。方法：將大鼠成骨細(xì)胞（ROS17/2.8）在不同葡萄糖濃度(5.5、25、45mM)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入不同濃度胰島素（0，10-7，10-6和10-5M）培養(yǎng)1、3、5、7、10d，M

12、TT法檢測細(xì)胞增殖；將細(xì)胞分別于不同糖濃度下（5.5、25、45mM）及胰島素(0、10-6mol/L)的干預(yù)下培養(yǎng)1、3、7、14、21d，ELISA試劑盒檢測prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白的表達(dá)。礦化21d，茜素紅染色，礦化定量分析，觀察對細(xì)胞礦化的影響。結(jié)果：①與5.5mM糖濃度相比，25mM高糖環(huán)境中大鼠成骨細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)，45mM高糖環(huán)境中細(xì)胞增殖活性顯著下降；②10-6M胰島素可顯著提高成骨細(xì)胞

13、在三種糖濃度中的增殖活性；③與5.5mM糖濃度相比，25mM組鈣結(jié)節(jié)較少，45mM組未見明顯的礦化結(jié)節(jié)，胰島素可改善細(xì)胞礦化情況；④高糖環(huán)境下prohibitin和peroxiredoxin-6在大鼠成骨細(xì)胞中的表達(dá)下降，45mM組蛋白下降更為顯著，10-6M胰島素可上調(diào)高糖環(huán)境中prohibitin和peroxiredoxin-6的表達(dá)；⑤Prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白均在成骨細(xì)胞分化第21d表達(dá)顯著，均在第