大黃有效部位及偉素對(duì)慢性環(huán)孢素腎病大鼠的防治研究.pdf

1、環(huán)孢霉素A(cyclosporine A,CsA)是由真菌產(chǎn)生的環(huán)狀11肽活性物質(zhì)。自1983年FDA批準(zhǔn)用于實(shí)體器官移植后,迅速成為器官移植抗排斥和自身免疫性疾病治療的一線藥物,臨床應(yīng)用較多,療效確切。但該藥的副作用特別是慢性腎毒性限制了它的廣泛應(yīng)用。由CsA腎毒性導(dǎo)致的慢性。腎功能進(jìn)行性衰退的慢性環(huán)孢素腎病(chronic cyclosporine nephropathy,CCN)以漸進(jìn)性腎功能不全、入球小動(dòng)脈透明樣變性、炎癥細(xì)胞浸

2、潤(rùn)、條索狀間質(zhì)纖維化和腎性免疫原性增加為主要特征性病理改變。Mihatsch等對(duì)腎移植患者的腎活檢資料進(jìn)行分析,證實(shí)CsA所致腎小管中毒的發(fā)生率為9％～37％,急性。腎功能衰竭伴彌漫性間質(zhì)纖維化的發(fā)生率為0％～19％,條索狀間質(zhì)纖維化以及CsA相關(guān)動(dòng)脈病變的發(fā)生率分別為5％～50％和5％～30％。研究認(rèn)為,CCN的病因與腎小球缺血、腎內(nèi)腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-agiotensin system,RAS)激活、細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

3、和自體吞噬、單核巨噬細(xì)胞(monocyte/macrophage,MC/MP)浸潤(rùn)及炎癥、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-betor 1,TGF-β1)與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)/金屬蛋白酶抑制因子(tissueinhibitor of metalloproteinases,TIMPs)調(diào)節(jié)失衡、骨橋蛋白、核因子-kappa B(nuclear

4、 factor-kappa B,NF-κB)、Toll-樣受體等有關(guān)。針對(duì)其發(fā)病機(jī)制,人們進(jìn)行了大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究,并試圖應(yīng)用西藥、中藥或采取減量甚至停用CsA的方式來(lái)防治CCN。
　　 大黃是我國(guó)傳統(tǒng)中藥之一,大黃有效部位(Rhubarb's effective parts,Pep)為大黃醇提液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂得到的洗脫物,包含以下五種成分:大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酸、蘆薈大黃素。文獻(xiàn)報(bào)道其在改善腦缺血、腦代謝及抗排斥

5、反應(yīng)方面效果顯著。偉素(舒洛地特,sulodexide)是經(jīng)過(guò)高度純化的生物制品,與肝素同屬糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)類藥物。GAG通常指一大類分子,包括肝素、低分子肝素、硫酸類肝素、硫酸類皮膚素以及糖胺聚糖類化合物,它們具有共同的生物學(xué)活性即保護(hù)腎臟的活性。偉素由兩種GAG組成,在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭芯哂蓄A(yù)防糖尿病腎病(dibetic nephropathy,DN)的活性,能夠抑制TGF-β1過(guò)度表達(dá)以及腎小球細(xì)

6、胞高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的基質(zhì)合成,修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)能障礙。但Rep和偉素是否可以通過(guò)改善腎臟缺血和代謝,對(duì)抗腎排斥反應(yīng)及保護(hù)腎臟活性等機(jī)制影響CCN的發(fā)生和發(fā)展,目前尚未可知,亦無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為此,我們復(fù)制了CCN大鼠模型,觀察不同劑量Rep和偉素在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)模型大鼠的干預(yù)和治療作用,并對(duì)其可能的作用機(jī)理進(jìn)行探討。
　　 本論文分以下2部分。
　　 第1部分 Rep及偉素對(duì)CCN大鼠的干預(yù)作用
　　 目的:

7、　　 觀察Rep及偉素對(duì)CCN的預(yù)防效果。
　　 方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)分組及生化指標(biāo)測(cè)定:SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠54只(180～200g),給予低鹽飼料,自由飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將動(dòng)物隨機(jī)分為9組,分別為:第一組正常對(duì)照組(VH3:橄欖油5ml·kg-1·d-1×28 d)；第二組模型組(MX3:CsA 25mg·kg-1·d-1×28 d)；第三組陽(yáng)性對(duì)照組(YDY:CsA25mg·kg-1·d-1+

8、貝那普利5mg·kg-1·d-1×28 d)；第四組Rep干預(yù)1組(DY1:Rep 50mg·kg-1·d-1×7 d,后給予CsA 25mg·kg-1·d-1+Pep 50mg·kg-1·d-1×28 d,二藥灌胃時(shí)間間隔2h以上)；第五組Rep干預(yù)2組(DY2.CsA25mg·kg-1·d-1+Rep 50mg·kg-1·d-1×28 d,二藥灌胃時(shí)間間隔2h以上):第六組Rep干預(yù)3組(DY3:CsA 25mg·kg-1·d-1×

9、7 d,后給予CsA25mg·kg-1·d-1+Rep 50mg·kg-1·d-1×21 d,二藥灌胃時(shí)間間隔2h以上)；第七組偉素干預(yù)1組(WY1:偉素10mg·kg-1·d-1×7 d,后給予CsA 25mg·kg-1·d-1+偉素10mg·kg-1·d-1×28 d)；第八組偉素干預(yù)2組(WY2:CsA 25mg·kg-1·d-1+偉素10mg·kg-1·d-1×28 d)；第九組偉素干預(yù)3組(WY3:CsA 25mg·kg-1·

10、d-1×7 d,后給予CsA 25mg·kg-1·d-1+偉素10mg·kg-1·d-1×21 d)。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),CsA及Rep為灌胃給藥,偉素為腹腔注射。所有大鼠均于第28天處死。實(shí)驗(yàn)期間在用藥前和用藥后的每周最后一天測(cè)量大鼠體重并調(diào)整灌胃和腹腔注射劑量。同時(shí)采集大鼠尾靜脈血,測(cè)定血肌酐(serum creatinine,Scr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)。
　　 2.取腎組織行HE、PAS及

11、Masson染色觀察病理變化,分析各組小動(dòng)脈透明樣變性、腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)情況并通過(guò)半定量積分評(píng)估其程度。入球小動(dòng)脈透明樣變性通過(guò)計(jì)數(shù)入球及球旁小動(dòng)脈病變來(lái)判斷。每個(gè)標(biāo)本至少檢查50個(gè)小動(dòng)脈,進(jìn)行下列評(píng)分:0=無(wú)透明樣變性；1=早期透明樣變性；2=明顯透明樣變性。RIF通過(guò)計(jì)數(shù)每個(gè)視野損傷面積的百分比來(lái)評(píng)估:0=正常腎間質(zhì),0.5=<5％,1=5％到15％,1.5=16％到25

12、％,2=26％到35％,2.5=36％到45％,3=>45％腎間質(zhì)面積損傷。
　　 3.同時(shí)取腎組織行電鏡檢查觀察超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 4.冰上分離腎臟并采取免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎組織CD68、Ⅲ型膠原及Ⅳ型膠原的表達(dá),逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)腎組織TGF-β1和TIMP-1 mRNA表達(dá),ELISA法檢測(cè)TGF-β1、TIMP-1和MMP-9蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論:1.偉素和Rep單獨(dú)干預(yù)用藥均

13、可減輕CsA腎毒性,甚至可消除其部分毒性,早期干預(yù)效果更好。2.采用偉素或Rep預(yù)防CsA腎毒性優(yōu)于貝那普利。3.偉素在改善小動(dòng)脈透明樣變性方面優(yōu)于Rep；改善RIF方面,提前給藥時(shí)偉素優(yōu)于Rep,而同時(shí)及后期給藥干預(yù)時(shí)效果相當(dāng),但干預(yù)機(jī)理不同。
　　 第2部分 Rep及偉素對(duì)CCN大鼠的治療作用
　　 目的:
　　 復(fù)制CCN模型,并于2周后停用CsA,觀察停用后腎毒性能否自行消除；同時(shí)觀察Rep及偉素對(duì)CCN

14、是否存在治療作用；并評(píng)估其療效。
　　 方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)分組:SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠78只(180～200 g),給予低鹽飼料,自由飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將動(dòng)物隨機(jī)分為9組分別為:第一組正常對(duì)照組(VH1:為對(duì)照1組,n=6,給予橄欖油5ml·kg-1·d-1×14 d,第14天處死；VH2:為對(duì)照2組,給予橄欖油5ml·kg-1·d-1×14 d,后改為注射用水5ml·kg-1·d-1×14 d,第2

15、8天處死；VH3:為對(duì)照3組,給予橄欖油5ml·kg-1·d-1×28 d,第28天處死)；第二組模型組(MX1:為模型1組,CsA25mg·kg-1·d-1×14 d,第14天處死；MX2:為模型2組,CsA 25mg·kg-1·d-1×14 d,后改為注射用水5ml·kg-1·d-1×14 d,第28天處死；MX3:為模型3組,給予CsA25mg·kg-1·d-1×28 d,第28天處死)；第三組陽(yáng)性對(duì)照組(YDZ:CsA25mg·

16、kg-1·d-1×14 d,后改為貝那普利5mg·kg-1·d-1×14 d)；第四組Rep治療1組(DZ1:CsA 25mg·kg-1·d-1×14 d,后改為Rep 25mg·kg-1·d-1×14d)；第五組Rep治療2組(DZ2:CsA 25mg·kg-1·d-1×14 d,后改為Rep50mg·kg-1·d-1×14 d)；第六組Rep治療3組(DZ3:CsA 25mg·kg-1·d-1×14 d,后改為Rep 100mg·k

17、g-1·d-1×14 d)；第七組偉素治療1組(WZ1:CsA25mg·kg-1·d-1×14 d,后改為偉素10mg·kg-1·d-1×14 d)；第八組偉素治療2組(WZ2:CsA 25mg·kg-1·d-1×14 d,后改為偉素20mg·kg-1·d-1×14 d)；第九組偉素治療3組(WZ3:CsA 25mg·kg-1·d-1×14 d,后改為偉素40mg·kg-1·d-1×14 d)。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)CsA及Rep為灌胃給藥,偉素為