rmhTRAIL治療RPMI8226荷瘤裸鼠移植瘤的合理劑量及藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、目的：多發(fā)性骨髓瘤（Mutipie myeloma，MM）是一種進(jìn)展性的疾病，應(yīng)用化學(xué)治療取得緩解或部分緩解后，大多數(shù)會(huì)復(fù)發(fā)，且易出現(xiàn)對多種化療藥物耐藥即多藥耐藥（MDR）。一旦出現(xiàn)MDR，即使加大藥物劑量也不易使患者再次獲得緩解。因此尋求治療多發(fā)性骨髓瘤新的有效藥物，延遲疾病復(fù)發(fā)時(shí)間，是目前多發(fā)性骨髓瘤研究的熱點(diǎn)。
　　 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF Related Apopt--osis Inducing Ligan

2、d，TRAIL）是Ⅱ型膜蛋白，通過與其特異性死亡受體（DR4，DR5）結(jié)合而激活凋亡信號傳導(dǎo)途徑，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且對正常細(xì)胞影響較小。目前美國和中國都已經(jīng)批準(zhǔn)TRAIL的臨床實(shí)驗(yàn)，但有關(guān)TRAIL對血液系統(tǒng)腫瘤尤其是多發(fā)性骨髓瘤的研究報(bào)道較少。
　　 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226荷廇裸鼠及昆明種小鼠研究目前新研制的重組變構(gòu)人腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL（recombinant mutant hum

3、an TRAIL，rmhTRAIL）抑制腫瘤的最佳給藥劑量及藥代動(dòng)力學(xué)。為rmhTRAIL作為一種新型的抗腫瘤生物制劑應(yīng)用于臨床治療多發(fā)性骨髓瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226培養(yǎng)與傳代
　　 人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226，培養(yǎng)于20％滅活胎牛血清（FBS，購自Gibco公司）、100U/ml青霉素和100μg/ml硫酸鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置37℃

4、、體積分?jǐn)?shù)5％的二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每5～6天傳代1次，試驗(yàn)用對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25％胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液。
　　 2、rmhTRAIL對荷瘤裸鼠的腫瘤殺傷作用的實(shí)驗(yàn)觀察
　　 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C-nu/nu裸鼠在SPF條下飼養(yǎng)，高效過濾器每小時(shí)換氣10～15次，相對濕度保持在46％～60％，每日保持10h的光照、14h無光的陰暗周期。
　　 2.2建立動(dòng)物模型在超凈臺內(nèi)將裸鼠右下肢外側(cè)皮膚用

5、75％酒精消毒后，皮下接種0.2ml8226懸液，濃度為1×107cell/只，待皮下移植瘤長至0.5cm3，隨機(jī)分為Ⅰ、Ⅱ?qū)嶒?yàn)組，每組分為7小組，每小組6只。各組rmhTRAIL均按每只裸鼠每次腹腔注射0.2mlrmhTRAIL（北京沙東公司）以生理鹽水配制成不同濃度，依據(jù)各組不同給藥天數(shù)，按實(shí)驗(yàn)要求注射。
　　 2.3 觀察各組裸鼠成瘤率各組以接種腫瘤細(xì)胞后3周為限，裸鼠右下肢外側(cè)皮下出現(xiàn)移植瘤大于0.5cm3為標(biāo)準(zhǔn)，成瘤率

6、=成瘤只數(shù)/總只數(shù)×100％。
　　 2.4 rmhTRAIL治療后各組抑瘤率以試驗(yàn)結(jié)束或裸鼠死亡時(shí)皮下剝離移植瘤為準(zhǔn)，按公式計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（％）=（對照組只數(shù)-實(shí)驗(yàn)組荷廇數(shù)/對照組只數(shù)）×100％。
　　 2.5 rmhTRAIL治療后各實(shí)驗(yàn)組8226裸鼠瘤體積變化每日用游標(biāo)卡尺測量瘤體長徑（a）和短徑（b），按移植瘤體積（V，mm3）=ab2/2計(jì)算，觀察3周，繪制生長曲線。
　　 2.6 rmhTRAI

7、L治療后8226荷唐裸鼠一般情況觀察觀察進(jìn)食、進(jìn)水量，激惹、嗜睡等不良反應(yīng)。
　　 3 rmhTRAIL血清藥代動(dòng)力學(xué)
　　 3.1藥物代謝動(dòng)物模型昆明種小鼠18只隨機(jī)分為6組，每組3只。在超凈臺內(nèi)用75％的酒精消毒右下腹內(nèi)側(cè)皮膚，各組均按每次腹腔注射0.2ml配制成不同濃度的rmhTRAIL（批號20080301）。
　　 分別于注射后30min，1h，2h，4h，6h，8h和24h，從小鼠眼眶靜脈叢取血（每次

8、50-150ul。第6組不取6h和8h時(shí)間點(diǎn)），室溫放置2h，離心3000rpm，10min，取血清測rmhTRAIL血藥濃度。
　　 3.2 ELISA方法測定rmhTRAIL血藥濃度
　　 （1）包被：anti-human TRAIL Capture mAb，1：250稀釋于包被緩沖液，100ul/孔，37℃孵育2hr。
　　 （2）封閉：1％BSA-PBS封閉，200ul/孔，37℃孵育1小時(shí)。
　　

9、 （3）加樣：系列稀釋的CPT標(biāo)準(zhǔn)品及恰當(dāng)稀釋的待測品分別加樣。100ul/孔，37℃孵育1小時(shí)。
　　 （4）檢測抗體（Detection antibody）及Streptavidin-HRP：Biotinylated anti human TRAIL mAb+streptavidin-HRP，均1：250稀釋于1％BSA-PBS，100ul/孔，37℃孵育1小時(shí)。
　　 （5）顯色：加TMB（四甲基聯(lián)苯胺）底物液顯

10、色，100ul/孔，室溫避光反應(yīng)10min。2M硫酸終止，50ul/孔。然后在酶標(biāo)儀上讀取OD450。（6）結(jié)果處理：按照標(biāo)準(zhǔn)品的OD450值-濃度取雙對數(shù)作直線回歸，求出直線公式并計(jì)算待測血清中TRAIL樣品濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出TRAIL樣品藥物代謝濃度。
　　 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：

11、r>　　 1 rmhTRAI抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長的最佳劑量
　　 1.1各組移植瘤成瘤率接種后3天后于接種處可見微小突起，以后逐漸明顯，接種后15d，有72只裸鼠移植瘤體積均超過1000mm3，接種成瘤率為85％。
　　 1.2 rmhTRAIL治療后各組抑瘤率比較
　　 1.2.1實(shí)驗(yàn)Ⅰ抑瘤率比較B組、E組移植瘤在d8抑瘤率達(dá)50％。B組腫瘤消退最快，在d12全部消退。其余各組在d14腫瘤全部消退，抑瘤率為1

12、00％。各組與對照組之間差異有顯著性（P<0.05）。
　　 1.2.2實(shí)驗(yàn)Ⅱ抑瘤率比較 a組腫瘤在d16全部消退，抑瘤率為100％。b組為50％，c組為83％，d組及e組為0％，f組為33.3％。a、b、c、f組與對照組之間差異有顯著性（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)顯示rmhTRAIL對PRMI8226抑瘤率呈劑量依賴性。
　　 1.3各組rmhTRAIL治療后荷瘤裸鼠瘤體積變化
　　 1.3.1實(shí)驗(yàn)Ⅰ rmhTRAI

13、L治療后荷瘤裸鼠瘤體積變化
　　 給藥后d2各實(shí)驗(yàn)組瘤體積出現(xiàn)減小，d4各組瘤體積較給藥前均縮小66％以上，各組d4與d0瘤體積比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），說明rmhTRAIL對8226移植瘤治療迅速有效。B組給藥總劑量為300mg/kg，在d4消退最明顯，腫瘤體積較前縮小84.3％，d12完全消退。其余各組均隨時(shí)間推移，瘤體積逐漸縮小， A、E、F組總劑量均為100mg/kg，不同給藥天數(shù)對于瘤體積變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P

14、>0.05），C組給藥總劑量為50mg/kg，A、C、D、E、F組均在d14腫瘤消退。各組與對照組之間存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在大劑量組瘤體積與rmhTRAIL之間呈劑量依賴性。
　　 1.3.2實(shí)驗(yàn)Ⅱ rmhTRAIL治療后荷瘤裸鼠瘤體積變化
　　 各組rmhTRAIL總劑量均為40 mg/kg，給藥后d0，d2，d4，d6，各實(shí)驗(yàn)組的移植瘤體積之間無明顯差異。

15、r>　　 1.4給藥后8226荷廇裸鼠一般情況觀察對照組荷廇鼠體重進(jìn)行性增大，各實(shí)驗(yàn)組未出現(xiàn)明顯進(jìn)食、進(jìn)水量減少、消瘦，激惹等不良反應(yīng)，顯示對rmhTRAIL的耐受較好。
　　 2 rmhTRAIL藥代動(dòng)力學(xué)腹腔給藥吸收情況個(gè)體差異較大，這可能與腹腔注射給藥本身有關(guān)。1組（20mg/kg）在給藥后1h血藥濃度達(dá)20000ng/ml，1組半衰期（T1/2）為3h，其余各組血藥濃度均在8000ng/ml以下，半衰期（T1/2）為4

16、h～6h。各組在給藥24h之內(nèi)血藥濃度降為0。有必要進(jìn)一步進(jìn)行靜脈給藥的藥代動(dòng)力學(xué)監(jiān)測。
　　 結(jié)論：
　　 1 rmhTRAIL可使多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226荷廇裸鼠移植腫瘤消退，呈時(shí)間和劑量相關(guān)性。
　　 2 本實(shí)驗(yàn)未觀察到增加rmhTRAIL濃度而導(dǎo)致的藥物毒副作用。
　　 3 rmhTRAIL的昆明種小鼠藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，各試驗(yàn)組rmhTRAIL24h體內(nèi)藥物濃度為0。峰值在rmhTRAIL注射后