灰葡萄孢細胞自噬相關(guān)基因BcATG26、BcATG17和BcATG14的功能研究.pdf

1、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)可危害一些重要經(jīng)濟作物，造成巨大的經(jīng)濟損失。目前細胞自噬在灰葡萄孢中的研究較少，在真核生物中，細胞自噬過程可維持細胞內(nèi)的生理平衡，有助于細胞度過逆境，并影響一些絲狀真菌細胞的分化及致病力。本研究在灰葡萄孢基因組數(shù)據(jù)庫中下載3個自噬相關(guān)基因的序列，即BC1G_12424、BC1G_11270和BC1G_01868，對其進行了基因結(jié)構(gòu)和同源性分析，采用Split-marker技術(shù)在野生型菌株B05

2、.10中對其分別進行了敲除，最后對敲除突變體的菌絲生長、菌核產(chǎn)生、營養(yǎng)需求和致病力等方面進行了測定。取得的研究結(jié)果如下:
　　(1)通過在NCBI上BLAST比對以及構(gòu)建進化樹，證實了BC1G_12424、BC1G_11270和BC1G_01868分別與多物種的自噬基因ATG26、ATG17和ATG14有同源性，因此命名為BcATG26、BcA TG17和BcA TG14。
　　(2)通過Split-marker技術(shù)分別敲除

3、基因BcATG26、BcA TG17和BcATG14，經(jīng)過PCR和Soutnern blot驗證，獲得了基因缺失突變體△BcATG26、△BcA TG17和△BcATG14。
　　(3)明確了自噬基因BcATG26、BcA TG17和BcA TG14在自噬過程中的重要作用。用MDC染色，B05.10的菌絲在激光共聚焦顯微鏡下出現(xiàn)大量的熒光顆粒，而△BcATG26-13、△BcATG17-6和△BcATG14-107的菌絲細胞中未見

4、或者有極少數(shù)的熒光顆粒，自噬基因的敲除阻斷了自噬過程，導(dǎo)致不能形成自噬體或者自噬小體。
　　(4)細胞自噬影響灰葡萄孢菌絲生長和菌核發(fā)育。基因缺失突變體在菌絲生長和菌核形成方面與野生型菌株B05.10有差異。在PDA培養(yǎng)基上，△BcA TG26-13相對于野生型菌株B05.10，菌核黑化延遲，15d仍為黃色;而△BcATG14-107只能形成很小的菌核。在1/8 PDA、DM、DM-C和DM-N培養(yǎng)基上，與野生型菌株B05.10相

5、比，△BcATG26-13、△BcA TG17-6和△BcA TG14-107菌絲生長速度減慢，菌落發(fā)育畸形。
　　(5)細胞自噬影響灰葡萄孢致病力。用菌絲塊離體接種煙草葉片、活體接種煙草葉片和離體接種草莓葉片測定致病力，結(jié)果表明，△BcATG26-13、△BcA TG17-6和△BcA TG14-107的致病力與野生型菌株B05.10相比有極顯著差異(P＜0.01)。
　　(6)細胞自噬可能影響灰葡萄孢耐受過氧化氫(H2O

6、2)和植保素(camalexin)的脅迫。在添加有H2O2或者植保素camalexin的PDA上，與野生型菌株B05.10相比，△BcATG26-13、△BcA TG17-6和△BcA TG14-107菌絲生長速度減慢，菌落發(fā)育畸形，即對H2O2和camalexin更為敏感。
　　以上結(jié)果表明，細胞自噬在灰葡萄孢菌絲生長、菌核的形成和發(fā)育、對寄主植物的致病力以及病原菌耐受活性氧（ROS）和植保素camalexin的脅迫等方面都起著