蠟梅抗寒相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CpICE1a、CpICE1b和CpDREB1的克隆及功能初探.pdf

1、蠟梅（Chimonanthus praecox L.）為蠟梅科蠟梅屬植物，以“耐寒、耐旱、耐剪”而著稱(chēng)，花期12月至翌年2月，傲雪屹立，凌寒怒放?；ㄊ侵参矬w對(duì)抗外界逆境最弱的部分，但是蠟梅花卻盛開(kāi)在嚴(yán)寒的冬季，推測(cè)蠟梅在抵御外界低溫的調(diào)控路徑中，可能存在一些功能比較特別的調(diào)控因子，目前，低溫信號(hào)途徑研究得比較清楚的是CBF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。CBF/DREB1基因位于CBF途徑的中心位置，調(diào)控表達(dá)受到各種信號(hào)因子的影響，在低溫應(yīng)答途徑中起到“

2、總開(kāi)關(guān)”的作用，ICE1基因是CBF的上游調(diào)控因子，可以通過(guò)結(jié)合CBF的啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控下游基因的表達(dá)，目前蠟梅抗寒性的研究主要集中在功能基因上，基于ICE1和CBF/DREB1基因在植物應(yīng)答低溫路徑上的重要作用，因此這兩類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的研究對(duì)了解蠟梅的抗寒機(jī)制有重要的意義。
　　基于本實(shí)驗(yàn)室之前發(fā)現(xiàn)的2個(gè)ICE類(lèi)的轉(zhuǎn)錄因子CpICE11和CpICE12，本實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容是克隆具有完整結(jié)構(gòu)域的CpICE1a、CpICE1b基因和1個(gè)DRE

3、B1類(lèi)基因—CpDREB1基因，并分析其功能，一方面運(yùn)用實(shí)時(shí)定量技術(shù)分析CpICE1a、CpICE1b和CpDREB1在蠟梅各個(gè)器官、花發(fā)育的不同階段和低溫條件下的表達(dá)量變化，然后構(gòu)建表達(dá)載體，運(yùn)用轉(zhuǎn)基因的手段將這三個(gè)基因轉(zhuǎn)入煙草中進(jìn)行功能探究，另一方面克隆CpDREB1的啟動(dòng)子序列，為之后研究CpICE1a、CpICE1b與CpDREB1的互作做基礎(chǔ)，主要結(jié)果如下:
　　(1)克隆CpICE1a、CpICE1b和CpDREB1的

4、開(kāi)放閱讀框，得到了CpICE1a、CpICE1b和CpDREB1在gDNA中全長(zhǎng)，對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CpDREB1無(wú)內(nèi)含子，CpICE1a和CpICE1b基因包含2個(gè)內(nèi)含子、3個(gè)外顯子，在結(jié)構(gòu)上，與擬南芥、蘋(píng)果、梅花、葡萄中ICE1類(lèi)基因的3個(gè)內(nèi)含子、4個(gè)外顯子不同，具有本物種的特殊性。
　　(2)克隆得到CpDREB1的啟動(dòng)子序列431bp，其中存在一個(gè)MYC結(jié)合位點(diǎn)和多個(gè)脅迫誘導(dǎo)調(diào)控作用位點(diǎn)，如:響應(yīng)茉莉酸甲酯(MeJA

5、)、赤霉素(GA)和水楊酸(SA)的作用元件。
　　(3)利用qPCR技術(shù)，檢測(cè)分析CpICE1a、CpICE1b與CpDREB1轉(zhuǎn)錄因子在蠟梅不同部位、花發(fā)育的不同階段和低溫條件下的表達(dá)情況。結(jié)果表明，CpICE1a、CpICE1b與CpDREB1在蠟梅的莖、葉、花、果及花發(fā)育的不同階段都有不同程度的表達(dá)，這三個(gè)基因都能響應(yīng)低溫脅迫，但是兩類(lèi)基因的表達(dá)模式不同，推測(cè)在蠟梅開(kāi)花階段為適應(yīng)低溫環(huán)境，維持自身生長(zhǎng)，可能存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制

6、。
　　(4)構(gòu)建CpICE1a、CpICE1b與CpDREB1表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入煙草中，分別得到轉(zhuǎn)基因煙草47株、47株和44株，在低溫處理探究基因功能方面，對(duì)長(zhǎng)勢(shì)一致的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行4度處理24h后，野生型失水萎蔫程度比轉(zhuǎn)基因植株的嚴(yán)重，4℃處理3h后，部分轉(zhuǎn)基因單株處理前后MDA含量的變化幅度比野生型小，其轉(zhuǎn)入的目的基因的表達(dá)量也高于其他單株，抗寒能力得到提高，通過(guò)半定量分析，在自然生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)CpICE1a和CpI

7、CE1b基因可以促進(jìn)煙草中NtLEA5基因的表達(dá)，而同樣為L(zhǎng)EA類(lèi)基因的NtERD10D的表達(dá)幾乎不變，而在轉(zhuǎn)CpDREB1的煙草中，即使CpDREB1的表達(dá)量很高，但是這兩個(gè)基因的表達(dá)沒(méi)有明顯的變化，說(shuō)明CpICE1a和CpICE1b的導(dǎo)入，在正常生長(zhǎng)條件下就可以提高煙草對(duì)逆境的抵抗能力，而CpDREB1在正常生長(zhǎng)條件下，可能不影響這兩個(gè)抗逆基因的表達(dá)。低溫處理后，在轉(zhuǎn)CpICE1a的煙草中，CpICE1a和NtERD10D的表達(dá)量升

8、高，而在CpDREB1的轉(zhuǎn)基因煙草中，低溫不影響CpDREB1和NtERD10D的表達(dá)，說(shuō)明在轉(zhuǎn)基因煙草中，低溫可以誘導(dǎo)CpICE1a的表達(dá)，并且影響其對(duì)下游功能基因的調(diào)控，而CpDREB1不受低溫誘導(dǎo)，而且NtERD10D可能不是CpDREB1在煙草中的下游靶基因，在冷脅迫的情況下，無(wú)論在野生型還是CpICE1a和CpDREB1的轉(zhuǎn)基因植株中，NtLEA5的表達(dá)都明顯升高，半定量的結(jié)果，顯示不出與野生型的區(qū)別，無(wú)法確定轉(zhuǎn)基因?qū)tLE