慢性體外反搏對動脈粥樣硬化豬血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響及其分子機制.pdf

1、本研究復制動脈粥樣硬化豬模型，并對其建立長期慢性體外反搏的干預，探討慢性體外反搏對血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響，并針對凋亡信號轉(zhuǎn)導通路，初步探索慢性體外反搏減輕血管內(nèi)皮細胞凋亡的可能分子機制。 第一部分 動脈粥樣硬化豬模型的復制和慢性體外反搏干預的建立 一．探討復制豬動脈粥樣硬化疾病模型的方法，并初步評價慢性體外反搏對防治動脈粥樣硬化的效果 方法：選擇豬齡20天雄性乳豬(n=18)，隨機分為正常飼養(yǎng)組(n=6)，高脂

2、飼養(yǎng)組(n=6)和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組(n=6)，正常飼養(yǎng)組用普通飼料喂養(yǎng)，其余兩組用普通飼料中按階段加入不同比例高膽固醇組分飼料喂養(yǎng)直至實驗結束，建立動脈粥樣硬化豬模型，并于豬齡三個月時開始對高脂飼養(yǎng)+體外反搏組進行36小時體外反搏治療。 結果： ①腹主動脈大體標本作蘇丹Ⅲ脂肪染色，圖像定量分析內(nèi)膜染色陽性面積占內(nèi)膜總面積的百分比，正常飼養(yǎng)組：1.66％±0.18％，高脂飼養(yǎng)組：9.48％±2.28％，高脂飼養(yǎng)+體

3、外反搏組：6.53％±0.81％。高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組較正常飼養(yǎng)組染色陽性比例明顯升高，但高脂飼養(yǎng)+體外反搏組較高脂飼養(yǎng)組有顯著降低(P<0.05)。 ②冠狀動脈左前降支HE染色顯示，在高脂飼養(yǎng)組光鏡下見血管腔內(nèi)有典型的動脈粥樣硬化斑塊形成，可見內(nèi)皮細胞排列紊亂、脫落，內(nèi)皮破損，內(nèi)膜下脂質(zhì)浸潤，中膜平滑肌增生活躍、排列紊亂，甚至突破內(nèi)彈力層侵入內(nèi)膜下增生，整個斑塊向管腔面突出，使管腔狹窄；高脂飼養(yǎng)+反搏組亦可見類

4、似改變，但上述病理改變程度減輕；正常飼養(yǎng)組冠狀動脈內(nèi)皮細胞呈單層排列，緊密有序，內(nèi)彈力層完整，內(nèi)膜下未見脂質(zhì)浸潤，中膜平滑肌增生不明顯，排列有序，管腔面連續(xù)流暢。 ③各實驗組動物腹主動脈透射電鏡觀察顯示，高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組腹主動脈透射電鏡下可見部分內(nèi)皮細胞胞膜皺縮、胞體脫落，有單核細胞在內(nèi)皮細胞表面黏附，內(nèi)膜下可見到單核細胞吞噬脂質(zhì)后成為巨噬細胞，而多個巨噬細胞融合而形成的泡沫細胞沉積；正常飼養(yǎng)組內(nèi)皮細胞呈梭形

5、，內(nèi)皮細胞與內(nèi)膜下層結合緊密，內(nèi)彈力板完整，內(nèi)皮下未見泡沫細胞形成。結論：通過高脂飼養(yǎng)成功建立豬動脈粥樣硬化疾病模型，慢性體外反搏明顯減輕動脈粥樣硬化的病理改變。 二.對動脈粥樣硬化豬慢性體外反搏的建立與實施 方法：使用實驗室自行設計的體外反搏儀、動物反搏床和反搏用囊套，對高脂飼養(yǎng)+體外反搏組動物用速眠新Ⅱ和3％戊巴比妥聯(lián)合麻醉后，進行共為時36小時的慢性體外反搏，每次2小時，隔日一次。反搏過程中實時監(jiān)測心率與指脈波，用

6、超聲多普勒測定反搏前后頸動脈血流速度μ血管內(nèi)徑ID，并留動脈血測定血液粘滯度η，用公式τ=-4ημ/ID計算并比較反搏前后血流切應力的改變，處死動物前用多普勒血流量計探頭和Millar測壓導管描記頸動脈血流量和有創(chuàng)血壓反搏前后的變化曲線。 結果： ①各組實驗動物包括正常飼養(yǎng)組(n=6)，高脂飼養(yǎng)組(n=6)和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組(n=6)均全部按實驗設計完成實驗。②反搏過程中對心電圖和指脈波的實時監(jiān)測可見反搏時在心動周期

7、中的舒張期指脈波有一個明顯的增壓波；對頸動脈反搏前后有創(chuàng)動態(tài)血壓和血流量進行監(jiān)測，描記的曲線提示反搏中舒張壓較反搏前增加，收縮壓較反搏前下降，頸動脈舒張期血流量較反搏前顯著增加，表明實驗干預是有效的體外反搏。 ③反搏前舒張期血流切應力(單位：dyne/cm<'2>)為22.13±7.17，反搏中舒張期血流剪切應力為45.91±14.10，反搏中舒張期血流切應力較反搏前明顯提高(P<0.05)；反搏前收縮期血流切應力為39.71±

8、16.72，反搏中收縮期血流剪切應力為43.71±12.29，反搏中收縮期血流切應力較反搏前輕微提高，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 結論：本研究對動脈粥樣硬化豬建立的慢性體外反搏干預是安全和有效的。 三．慢性體外反搏對動脈粥樣硬化豬內(nèi)皮依賴和非內(nèi)皮依賴血管舒張功能的影響 方法：對各組動物離體頸動脈血管環(huán)進行體外灌流，用等長張力轉(zhuǎn)換器和多導生理記錄儀測定用苯腎上腺素預收縮的頸動脈血管環(huán)對濃度梯度為10<'-8>

9、～10<'-5>mol／L的乙酰膽堿和硝普鈉的舒張反應，以反映其內(nèi)皮依賴和非內(nèi)皮依賴的血管舒張功能的變化。 結論：高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組內(nèi)皮依賴血管舒張功能和非內(nèi)皮依賴血管舒張功能較正常飼養(yǎng)組明顯受損，慢性體外反搏干預可以使動脈粥樣硬化豬內(nèi)皮依賴和非內(nèi)皮依賴血管舒張功能明顯改善。 第二部分慢性體外反搏對動脈粥樣硬化豬血管內(nèi)皮細胞 一、慢性體外反搏對動脈粥樣硬化豬血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響 方法：用

10、掃描電鏡和透射電鏡定性地觀察動脈粥樣硬化豬腹主動脈血管內(nèi)皮細胞凋亡的形態(tài)學變化，并對Ⅰ型膠原酶灌流消化獲得的豬主動脈血管內(nèi)皮細胞用Tunel法定量地觀察慢性體外反搏對動脈粥樣硬化豬血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響。 結果： ①用掃描電鏡觀察正常飼養(yǎng)組、高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組的腹主動脈內(nèi)皮，可見正常飼養(yǎng)組血管內(nèi)皮細胞排列整齊，表面光滑，細胞形狀呈梭狀與血流方向一致，內(nèi)皮細胞大小比較一致，胞膜完整；高脂飼養(yǎng)組血管內(nèi)皮細胞排列

11、紊亂，內(nèi)皮細胞有明顯脫落，部分細胞胞膜皺縮，體積明顯減小，符合凋亡細胞的外形特征；高脂飼養(yǎng)+體外反搏組血管內(nèi)皮細胞排列紊亂的情形明顯減輕，內(nèi)皮細胞脫落減少，皺縮細胞較高脂飼養(yǎng)組明顯減少。 ②透射電鏡觀察血管內(nèi)皮細胞在凋亡的不同階段的形態(tài)學改變情況，可見正常血管內(nèi)皮細胞胞膜完整、連續(xù)，細胞核的染色質(zhì)均勻疏松；凋亡的血管內(nèi)皮細胞胞膜皺縮、突起，胞體縮小，細胞核染色質(zhì)邊集、固縮、碎裂，可見凋亡小體形成。 ③Tunel法測定正常

12、飼養(yǎng)組，高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組的凋亡指數(shù)分別為(127±36)‰， (237±23)‰和(177±12)‰，高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組主動脈血管內(nèi)皮細胞的凋亡指數(shù)顯著高于正常飼養(yǎng)組(p<0.01)，而高脂飼養(yǎng)+體外反搏組血管主動脈內(nèi)皮細胞的凋亡指數(shù)較高脂飼養(yǎng)組明顯降低(p<0.05)。 結論：慢性體外反搏減輕動脈粥樣硬化豬血管內(nèi)皮細胞的凋亡。 二、慢性體外反搏減輕動脈粥樣硬化豬血管內(nèi)皮細胞凋亡的可能分子

13、機制 方法：對Ⅰ型膠原酶灌流消化獲得的各實驗組動物的主動脈血管內(nèi)皮細胞進行與凋亡相關的二個蛋白質(zhì)：凋亡酶激活因子1(Apoptotic proteinase activatingfactor 1，Apaf 1)及凋亡抑制蛋白2(baculoviral IAP repeat-containing 2，BrRC2)的免疫細胞化學分析，并用RT-PCR方法分析比較其轉(zhuǎn)錄水平的改變，初步探討慢性體外反搏影響血管內(nèi)皮細胞凋亡的可能分子機制

14、。 結果： ①免疫細胞化學染色結果 正常飼養(yǎng)組，高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組主動脈血管內(nèi)皮細胞的蛋白質(zhì)Apaf 1免疫細胞化學染色陽性率分別為(168±30)‰，(293±12)‰和(249±11)‰，高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組主動脈血管內(nèi)皮細胞的染色陽性率顯著高于正常飼養(yǎng)組(p<0.01)，高脂飼養(yǎng)+體外反搏組主動脈血管內(nèi)皮細胞的染色陽性率較高脂飼養(yǎng)組明顯降低(p<0.05)。 ②Apaf 1

15、和BIRC2免疫細胞化學染色陽性率與血管內(nèi)皮細胞凋亡指數(shù)的相關分析 蛋白質(zhì)Apaf 1免疫細胞化學染色陽性率與內(nèi)皮細胞凋亡指數(shù)的Pearson相關分析結果提示呈正相關關系，r=0.877，P<0.01：與其相反，蛋白質(zhì)BIRC2免疫細胞化學染色陽性率與內(nèi)皮細胞凋亡指數(shù)的Pearson相關分析結果提示呈負相關關系，r=-0.888，P<0.01。 ③Apaf 1和BIRC2的RT-PCR結果 正常飼養(yǎng)組、高脂飼養(yǎng)組

16、和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組主動脈血管內(nèi)皮細胞基因Apaf1的RT—PCR產(chǎn)物與各自內(nèi)參照ACTB(即β-actin)灰度的相對比值分別為(0.57±0.13),(1.79±0.19)和(1.16±0.20)，高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組的相對比值顯著高于正常飼養(yǎng)組(p<0.01)，高脂飼養(yǎng)+體外反搏組的相對比值較高脂飼養(yǎng)組明顯降低(p<0.05)。 ④Apaf 1和BIRC2免疫細胞化學染色陽性率與對應基因mRNA相對表達水平的

17、相關分析蛋白質(zhì)Apaf 1免疫細胞化學染色陽性率與其基因mRNA相對表達水平的Pearson相關分析結果提示呈正相關關系，r=0.868，P<0.01；蛋白質(zhì)BIRC2免疫細胞化學染色陽性率與其基因mRNA相對表達水平的Pearson相關分析結果提示呈正相關關系，r=0.912，P<0.01。 結論：慢性體外反搏減輕動脈粥樣硬化豬血管內(nèi)皮細胞的凋亡，慢性體外反搏可能通過上調(diào)基因BIRC2的表達和下調(diào)Apaf 1的表達從而阻遏