慢性體外反搏對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化豬血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、本研究復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化豬模型，并對(duì)其建立長(zhǎng)期慢性體外反搏的干預(yù)，探討慢性體外反搏對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，并針對(duì)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，初步探索慢性體外反搏減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制。 第一部分 動(dòng)脈粥樣硬化豬模型的復(fù)制和慢性體外反搏干預(yù)的建立 一．探討復(fù)制豬動(dòng)脈粥樣硬化疾病模型的方法，并初步評(píng)價(jià)慢性體外反搏對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化的效果 方法：選擇豬齡20天雄性乳豬(n=18)，隨機(jī)分為正常飼養(yǎng)組(n=6)，高脂

2、飼養(yǎng)組(n=6)和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組(n=6)，正常飼養(yǎng)組用普通飼料喂養(yǎng)，其余兩組用普通飼料中按階段加入不同比例高膽固醇組分飼料喂養(yǎng)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，建立動(dòng)脈粥樣硬化豬模型，并于豬齡三個(gè)月時(shí)開(kāi)始對(duì)高脂飼養(yǎng)+體外反搏組進(jìn)行36小時(shí)體外反搏治療。 結(jié)果： ①腹主動(dòng)脈大體標(biāo)本作蘇丹Ⅲ脂肪染色，圖像定量分析內(nèi)膜染色陽(yáng)性面積占內(nèi)膜總面積的百分比，正常飼養(yǎng)組：1.66％±0.18％，高脂飼養(yǎng)組：9.48％±2.28％，高脂飼養(yǎng)+體

3、外反搏組：6.53％±0.81％。高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組較正常飼養(yǎng)組染色陽(yáng)性比例明顯升高，但高脂飼養(yǎng)+體外反搏組較高脂飼養(yǎng)組有顯著降低(P<0.05)。 ②冠狀動(dòng)脈左前降支HE染色顯示，在高脂飼養(yǎng)組光鏡下見(jiàn)血管腔內(nèi)有典型的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂、脫落，內(nèi)皮破損，內(nèi)膜下脂質(zhì)浸潤(rùn)，中膜平滑肌增生活躍、排列紊亂，甚至突破內(nèi)彈力層侵入內(nèi)膜下增生，整個(gè)斑塊向管腔面突出，使管腔狹窄；高脂飼養(yǎng)+反搏組亦可見(jiàn)類

4、似改變，但上述病理改變程度減輕；正常飼養(yǎng)組冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞呈單層排列，緊密有序，內(nèi)彈力層完整，內(nèi)膜下未見(jiàn)脂質(zhì)浸潤(rùn)，中膜平滑肌增生不明顯，排列有序，管腔面連續(xù)流暢。 ③各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物腹主動(dòng)脈透射電鏡觀察顯示，高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組腹主動(dòng)脈透射電鏡下可見(jiàn)部分內(nèi)皮細(xì)胞胞膜皺縮、胞體脫落，有單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附，內(nèi)膜下可見(jiàn)到單核細(xì)胞吞噬脂質(zhì)后成為巨噬細(xì)胞，而多個(gè)巨噬細(xì)胞融合而形成的泡沫細(xì)胞沉積；正常飼養(yǎng)組內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形

5、，內(nèi)皮細(xì)胞與內(nèi)膜下層結(jié)合緊密，內(nèi)彈力板完整，內(nèi)皮下未見(jiàn)泡沫細(xì)胞形成。結(jié)論：通過(guò)高脂飼養(yǎng)成功建立豬動(dòng)脈粥樣硬化疾病模型，慢性體外反搏明顯減輕動(dòng)脈粥樣硬化的病理改變。 二.對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化豬慢性體外反搏的建立與實(shí)施 方法：使用實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的體外反搏儀、動(dòng)物反搏床和反搏用囊套，對(duì)高脂飼養(yǎng)+體外反搏組動(dòng)物用速眠新Ⅱ和3％戊巴比妥聯(lián)合麻醉后，進(jìn)行共為時(shí)36小時(shí)的慢性體外反搏，每次2小時(shí)，隔日一次。反搏過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)心率與指脈波，用

6、超聲多普勒測(cè)定反搏前后頸動(dòng)脈血流速度μ血管內(nèi)徑ID，并留動(dòng)脈血測(cè)定血液粘滯度η，用公式τ=-4ημ/ID計(jì)算并比較反搏前后血流切應(yīng)力的改變，處死動(dòng)物前用多普勒血流量計(jì)探頭和Millar測(cè)壓導(dǎo)管描記頸動(dòng)脈血流量和有創(chuàng)血壓反搏前后的變化曲線。 結(jié)果： ①各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括正常飼養(yǎng)組(n=6)，高脂飼養(yǎng)組(n=6)和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組(n=6)均全部按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)完成實(shí)驗(yàn)。②反搏過(guò)程中對(duì)心電圖和指脈波的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)可見(jiàn)反搏時(shí)在心動(dòng)周期

7、中的舒張期指脈波有一個(gè)明顯的增壓波；對(duì)頸動(dòng)脈反搏前后有創(chuàng)動(dòng)態(tài)血壓和血流量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，描記的曲線提示反搏中舒張壓較反搏前增加，收縮壓較反搏前下降，頸動(dòng)脈舒張期血流量較反搏前顯著增加，表明實(shí)驗(yàn)干預(yù)是有效的體外反搏。 ③反搏前舒張期血流切應(yīng)力(單位：dyne/cm<'2>)為22.13±7.17，反搏中舒張期血流剪切應(yīng)力為45.91±14.10，反搏中舒張期血流切應(yīng)力較反搏前明顯提高(P<0.05)；反搏前收縮期血流切應(yīng)力為39.71±

8、16.72，反搏中收縮期血流剪切應(yīng)力為43.71±12.29，反搏中收縮期血流切應(yīng)力較反搏前輕微提高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 結(jié)論：本研究對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化豬建立的慢性體外反搏干預(yù)是安全和有效的。 三．慢性體外反搏對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化豬內(nèi)皮依賴和非內(nèi)皮依賴血管舒張功能的影響 方法：對(duì)各組動(dòng)物離體頸動(dòng)脈血管環(huán)進(jìn)行體外灌流，用等長(zhǎng)張力轉(zhuǎn)換器和多導(dǎo)生理記錄儀測(cè)定用苯腎上腺素預(yù)收縮的頸動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)濃度梯度為10<'-8>

9、～10<'-5>mol／L的乙酰膽堿和硝普鈉的舒張反應(yīng)，以反映其內(nèi)皮依賴和非內(nèi)皮依賴的血管舒張功能的變化。 結(jié)論：高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組內(nèi)皮依賴血管舒張功能和非內(nèi)皮依賴血管舒張功能較正常飼養(yǎng)組明顯受損，慢性體外反搏干預(yù)可以使動(dòng)脈粥樣硬化豬內(nèi)皮依賴和非內(nèi)皮依賴血管舒張功能明顯改善。 第二部分慢性體外反搏對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化豬血管內(nèi)皮細(xì)胞 一、慢性體外反搏對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化豬血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 方法：用

10、掃描電鏡和透射電鏡定性地觀察動(dòng)脈粥樣硬化豬腹主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，并對(duì)Ⅰ型膠原酶灌流消化獲得的豬主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞用Tunel法定量地觀察慢性體外反搏對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化豬血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果： ①用掃描電鏡觀察正常飼養(yǎng)組、高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組的腹主動(dòng)脈內(nèi)皮，可見(jiàn)正常飼養(yǎng)組血管內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，表面光滑，細(xì)胞形狀呈梭狀與血流方向一致，內(nèi)皮細(xì)胞大小比較一致，胞膜完整；高脂飼養(yǎng)組血管內(nèi)皮細(xì)胞排列

11、紊亂，內(nèi)皮細(xì)胞有明顯脫落，部分細(xì)胞胞膜皺縮，體積明顯減小，符合凋亡細(xì)胞的外形特征；高脂飼養(yǎng)+體外反搏組血管內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂的情形明顯減輕，內(nèi)皮細(xì)胞脫落減少，皺縮細(xì)胞較高脂飼養(yǎng)組明顯減少。 ②透射電鏡觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞在凋亡的不同階段的形態(tài)學(xué)改變情況，可見(jiàn)正常血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜完整、連續(xù)，細(xì)胞核的染色質(zhì)均勻疏松；凋亡的血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜皺縮、突起，胞體縮小，細(xì)胞核染色質(zhì)邊集、固縮、碎裂，可見(jiàn)凋亡小體形成。 ③Tunel法測(cè)定正常

12、飼養(yǎng)組，高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組的凋亡指數(shù)分別為(127±36)‰， (237±23)‰和(177±12)‰，高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著高于正常飼養(yǎng)組(p<0.01)，而高脂飼養(yǎng)+體外反搏組血管主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡指數(shù)較高脂飼養(yǎng)組明顯降低(p<0.05)。 結(jié)論：慢性體外反搏減輕動(dòng)脈粥樣硬化豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。 二、慢性體外反搏減輕動(dòng)脈粥樣硬化豬血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的可能分子

13、機(jī)制 方法：對(duì)Ⅰ型膠原酶灌流消化獲得的各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行與凋亡相關(guān)的二個(gè)蛋白質(zhì)：凋亡酶激活因子1(Apoptotic proteinase activatingfactor 1，Apaf 1)及凋亡抑制蛋白2(baculoviral IAP repeat-containing 2，BrRC2)的免疫細(xì)胞化學(xué)分析，并用RT-PCR方法分析比較其轉(zhuǎn)錄水平的改變，初步探討慢性體外反搏影響血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制

14、。 結(jié)果： ①免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果 正常飼養(yǎng)組，高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)Apaf 1免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性率分別為(168±30)‰，(293±12)‰和(249±11)‰，高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的染色陽(yáng)性率顯著高于正常飼養(yǎng)組(p<0.01)，高脂飼養(yǎng)+體外反搏組主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的染色陽(yáng)性率較高脂飼養(yǎng)組明顯降低(p<0.05)。 ②Apaf 1

15、和BIRC2免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性率與血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)的相關(guān)分析 蛋白質(zhì)Apaf 1免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性率與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)的Pearson相關(guān)分析結(jié)果提示呈正相關(guān)關(guān)系，r=0.877，P<0.01：與其相反，蛋白質(zhì)BIRC2免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性率與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)的Pearson相關(guān)分析結(jié)果提示呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，r=-0.888，P<0.01。 ③Apaf 1和BIRC2的RT-PCR結(jié)果 正常飼養(yǎng)組、高脂飼養(yǎng)組

16、和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞基因Apaf1的RT—PCR產(chǎn)物與各自內(nèi)參照ACTB(即β-actin)灰度的相對(duì)比值分別為(0.57±0.13),(1.79±0.19)和(1.16±0.20)，高脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)+體外反搏組的相對(duì)比值顯著高于正常飼養(yǎng)組(p<0.01)，高脂飼養(yǎng)+體外反搏組的相對(duì)比值較高脂飼養(yǎng)組明顯降低(p<0.05)。 ④Apaf 1和BIRC2免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性率與對(duì)應(yīng)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的

17、相關(guān)分析蛋白質(zhì)Apaf 1免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性率與其基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的Pearson相關(guān)分析結(jié)果提示呈正相關(guān)關(guān)系，r=0.868，P<0.01；蛋白質(zhì)BIRC2免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性率與其基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的Pearson相關(guān)分析結(jié)果提示呈正相關(guān)關(guān)系，r=0.912，P<0.01。 結(jié)論：慢性體外反搏減輕動(dòng)脈粥樣硬化豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，慢性體外反搏可能通過(guò)上調(diào)基因BIRC2的表達(dá)和下調(diào)Apaf 1的表達(dá)從而阻遏