血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR4介導(dǎo)漢灘病毒引起IRF3和NF-ΚB的核移位研究.pdf

1、漢灘病毒(Hantaan virus，HTNV)為布尼亞病毒科(family Bunyaviridae)漢坦病毒屬（Hantavirus，HV）的一種單股分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒。HTNV雖以嚙齒類動(dòng)物為儲(chǔ)存宿主，卻不引起宿主發(fā)病，然而在人類可引起兩類急性傳染?。耗I綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)和漢坦病毒肺綜合征(hantavirus pulmonary syndrom

2、e,HPS)。全世界每年大約有15萬HFRS和HPS患者，其中HFRS病例的90％以上發(fā)生在亞洲。我國(guó)是世界上HFRS疫情最嚴(yán)重的國(guó)家，HTNV是引起我國(guó)重癥HFRS的主要病原體，因此，HTNV/HFRS嚴(yán)重危害人民的健康。
　　自1978年首次從宿主動(dòng)物中成功分離HV以來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)HV及其相關(guān)疾病的病原學(xué)、流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)制、診斷及防治等方面進(jìn)行了大量的研究并取得了一系列的成果，但其發(fā)病的分子機(jī)制尚未完全明了，也沒有特異有效

3、的治療措施，安全有效的疫苗尚待進(jìn)一步開發(fā)。因此，探討HV感染致病的分子機(jī)理，尋找有效的抗病毒治療藥物及研制新型HV疫苗，一直是相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　目前普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為，HV相關(guān)疾病是由免疫介導(dǎo)的病理反應(yīng)所致。固有免疫（innate immunity）作為機(jī)體抗感染免疫的第一道防線，在漢坦病毒感染及發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用，然而HV誘導(dǎo)固有免疫的分子機(jī)制尚不清楚。HV主要通過感染血管內(nèi)皮細(xì)胞從而引起機(jī)體的免疫病理反應(yīng)。TLR4是

4、血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的一種重要的膜分子，參與內(nèi)皮細(xì)胞抗感染的固有免疫反應(yīng)。LPS是TLR4的主要配體，但是近年來發(fā)現(xiàn)TLR4在抗病毒免疫中也發(fā)揮了重要作用，HTNV可能通過與TLR4的相互作用誘發(fā)機(jī)體的固有免疫反應(yīng)。前期我們研究發(fā)現(xiàn)，HTNV76-118株感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系EVC304后可誘導(dǎo)TLR4的表達(dá)升高，進(jìn)一步采用RNAi技術(shù)，構(gòu)建了EVC304TLR4-細(xì)胞系，以此為基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)TLR4介導(dǎo)HTNV感染EVC304細(xì)胞所導(dǎo)致的IF

5、N-β，IL-6和TNF-α的表達(dá)升高，TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中TRIF的表達(dá)在HTNV感染前后變化明顯，而MyD88的表達(dá)變化不明顯。本研究以上述為基礎(chǔ)，通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察TLR4下游轉(zhuǎn)錄因子IRF-3和NF-κB的細(xì)胞核移位以及它與HTNV感染的時(shí)程關(guān)系，同時(shí)以RT-PCR和間接免疫熒光方法觀察HTNV感染EVC304細(xì)胞后，TLR4是否介導(dǎo)細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）的表達(dá)變化，闡明TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在HTNV感染EV

6、C304細(xì)胞中的作用，為HFRS的發(fā)病機(jī)理研究和藥物研制提供新資料。
　　本課題研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.HTNV的培養(yǎng)及其對(duì)EVC304細(xì)胞的感染
　　培養(yǎng)Vero細(xì)胞，然后用本室所保存的HTNV76-118株感染Vero細(xì)胞，通過Vero細(xì)胞的傳代進(jìn)一步擴(kuò)增HTNV，7-10天后反復(fù)凍融Vero細(xì)胞并分離上清。然后培養(yǎng)EVC304TLR4+細(xì)胞和EVC304TLR4-細(xì)胞，用制備的HTNV上清分別感染，發(fā)現(xiàn)HT

7、NV可以有效地感染這兩種細(xì)胞。
　　2.EVC304TLR4-細(xì)胞中的TLR4表達(dá)檢測(cè)
　　分別培養(yǎng)EVC304TLR4+細(xì)胞和EVC304TLR4-細(xì)胞，各取1×106個(gè)細(xì)胞提取總RNA，用半定量RT-PCR來檢測(cè)兩種細(xì)胞中TLR4的表達(dá)情況。結(jié)果表明在EVC304TLR4-細(xì)胞中TLR4表達(dá)水平很低（即在該細(xì)胞中TLR4能被有效抑制），提示EVC304TLR4-細(xì)胞可以在本實(shí)驗(yàn)中用于研究TLR4的基因功能。
　　3

8、.轉(zhuǎn)錄因子IRF-3和NF-kB的細(xì)胞核移位及其與HTNV感染的時(shí)程關(guān)系
　　HTNV分別感染EVC304TLR4+細(xì)胞和EVC304TLR4-細(xì)胞，以LPS刺激作為陽性對(duì)照組，以未進(jìn)行任何刺激組作為陰性對(duì)照組。觀察在感染后0.5h、1h、3h、6h、12h后轉(zhuǎn)錄因子IRF-3和NF-kB的細(xì)胞核移位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有組中刺激0.5h后IRF-3和NF-kB都沒有發(fā)生細(xì)胞核移位，在感染EVC304TLR4+細(xì)胞1h、3h、6h后

9、IRF-3和NF-kB發(fā)生了細(xì)胞核移位，其中以感染6h的細(xì)胞核移位最為明顯，而在12h時(shí)沒有觀察到細(xì)胞核移位現(xiàn)象。在HTNV感染EVC304TLR4-各組中各個(gè)時(shí)段均未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核移位現(xiàn)象。
　　4.粘附分子ICAM-1在HTNV感染前后的表達(dá)
　　HTNV分別感染EVC304TLR4+細(xì)胞和EVC304TLR4-細(xì)胞6h后，用RT-PCR和間接免疫熒光技術(shù)分別檢測(cè)粘附分子ICAM-1的表達(dá)變化，結(jié)果顯示HTNV感染EVC30

10、4前后以及TLR4基因沉默前后ICAM-1變化不明顯，且陽性對(duì)照組變化亦不明顯。
　　結(jié)論：HTNV①感染EVC304細(xì)胞后TLR4可能介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子IRF-3和NF-kB的細(xì)胞核移位，且在一定時(shí)間內(nèi)（1-6h），核移位隨感染時(shí)間延長(zhǎng)而增加。HTNV②感染EVC304細(xì)胞前后，ICAM-1變化不明顯，且與TLR4沉默與否無明顯關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)初步闡明了在HTNV感染EVC304細(xì)胞中TLR4所引起的固有免疫信號(hào)通路活化的分子機(jī)制，為HF